黑骨藤對高表達表皮生長因子受體突變體Ⅲ的人膠質母細胞瘤細胞DKMG的影響及機制*

唐銀彤,官志忠,陸定艷,陳帥帥,吳忠秀,曹陶濤,郭瑋鈺,劉亭*

(1.貴州醫科大學 藥學院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 &貴州省醫學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽 550001; 4.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心,貴州 貴陽 550004)

近年來,惡性腫瘤的發病率正逐步上升,國際癌癥機構最新全球癌癥數據也提示惡性腫瘤的預防及治療至關重要[1-3]。治療惡性腫瘤的方法包括放射、化學及手術治療等,但都因具有嚴重的毒副作用而導致患者預后效果不理想,長期生存率也較低[4]。隨著技術的發展,靶向治療方案逐漸進入人們的視野[5],并被證明在惡性腫瘤治療方面具有較好功效[6-7]。在表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)家族中,EGF受體突變體Ⅲ(EGF receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)是常見的變異型[8],它是惡性腫瘤的特異性受體,僅在腫瘤細胞表面表達[9];約80%的惡性腫瘤患者過表達EGFRvⅢ基因,包括直腸癌、白血病、卵巢癌、胸腺癌、肺癌和膠質母細胞瘤等[10-15];EGFRvⅢ參與信號轉導、轉錄等過程,其通常存在于擴增產物中,該類型的突變會導致大量的基因拷貝,從而促進細胞的生長信號轉導和有絲分裂,最終加快惡性腫瘤的發展病程[16-18]。因此,針對EGFRvⅢ抗癌藥物的開發成為治療惡性腫瘤的熱點之一[19]。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr)是滇杠柳的干燥根、全株,具有抗腫瘤、祛風除濕及通經活血等功效[20],系貴州“十大苗藥”之一,當地居民常以水煎煮、酒劑服用,治療風濕痛、擦傷及腫瘤等各種痹病,其提取物具有抗腫瘤活性。研究表明,黑骨藤的乙酸乙酯部位對腫瘤抑制率可高達97.48%,且對白血病的抑制率可達到80.71%[21]。高表達EGFRvⅢ的膠質母細胞瘤細胞系DKMG細胞(human glioblastoma cell line DKMG cells,DKMG)和不表達EGFRvⅢ的人腦星形膠質母細胞瘤細胞系U87MG細胞(U87MG)常用于惡性腫瘤的研究[22],本研究將利用DKMG細胞,探討黑骨藤對其細胞存活率、凋亡率的影響,從信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)及蛋白層面驗證EGFRvⅢ、BCL2-Associated X(Bax)蛋白質及B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達情況,從而闡明黑骨藤殺傷DKMG細胞的作用及其機制,為其深入開發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 過表達EGFRvⅢ的人膠質母細胞瘤細胞株DKMG來源于江西阿普斯戴爾生物技術有限公司,不表達EGFRvⅢ的人腦星形膠質母細胞瘤細胞株U87MG由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.1.2主要藥品與試劑 黑骨藤(貴陽萬東橋),由貴州醫科大學生藥學教研室劉春花副教授鑒定;血清、Dulbecco's Modified Eagle Medium培養液(DMEM,美國Gibco),胰酶(美國Thermo),Eastep Super總RNA提取試劑盒、MTS細胞增殖與毒力檢測試劑盒(MTS cell proliferation and cytotoxicity detection kit,MTS;北京Promega),凋亡試劑盒(美國BD),實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)所需TB Green qPCR Master Mix(北京Biomed),5×PrimeScript RT Master Mix逆轉錄試劑(日本TaKaRa),引物(上海英俊生物技術有限公司)。EGFRvⅢ引物上、下游分別為5′-GAGTACTGATCGCGAGAG-3′和5′-CTTCTGATAGCTGTCTGC-3′,Bcl-2上、下游分別為5′-ATGTGTCTGGAGAGCGTCA-3′和5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3′,Bax上、下游分別為5′-GGTTGTCGCCCTCTTCTACTT-3′和5′-GGAGGAAGTCCAATGTCCAG-3′,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上、下游分別為5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′和5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、甘氨酸(glycine,Gly)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、蛋白濃度測定試劑盒(BCA assay,BCA)及牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA;北京Solarbio),苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA蛋白裂解液(RIPA lysis buffer,RIPA;大連美倫生物科技),BeyoECL Plus超敏ECL化學發光試劑盒(上海Beyotime),甲醇(國藥集團),蛋白預染Maker(上海absin),聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF;德國Millipore),肌動蛋白(Actin,β-actin)、EGFRvⅢ、半胱氨酸蛋酶家族(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3或Cleaved caspase-3)、Bax、Bcl-2一抗及山羊抗兔二抗(英國Abcam)。

1.1.3主要儀器 N50型核酸蛋白檢測儀(德國IM-PLEN),BLOCOL層析柜(北京博醫康實驗儀器有限公司),Fresco型冷凍離心機和5%CO2培養箱(美國Thermo),690型酶標儀(上海伯樂),TS200型倒置顯微鏡(日本Nikon),流式細胞儀(美國BD),CFX型實時熒光定量PCR儀、Power Pac Basic型垂直電泳儀、Trans-Blot型蛋白快速濕轉轉印儀及GBOXChemiXL1.4型凝膠成像系統(美國Bio-rad)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 利用10% FBS及90% DMEM基本培養液培養DKMG、U87MG細胞,并置于5%CO2、37 ℃的培養箱中培養;取P4～P10代生長期且狀態較好的細胞,進行擴大培養及實驗。

1.2.2細胞分組及細胞毒性檢測 取生長期的DKMG和U87MG細胞接種于96孔培養板中,細胞密度為2.0×108個/L,待細胞匯合度為80%時,棄舊培養基,分別將2種細胞設為空白(Control,Con)組、100 mg/L(低濃度)黑骨藤組、200 mg/L(中濃度)黑骨藤組及400 mg/L(高濃度)黑骨藤組,空白組加DMEM培養液,其余各組加黑骨藤,并使其終濃度為100、200及400 mg/L的培養液;各組藥物作用細胞24 h,采用MTS檢測各組的吸光度(absorbance,A)值,并計算各組細胞的存活率。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 取生長期的DKMG細胞接種于6孔板培養24 h,按“1.2.2”項下分組處理24 h,PBS洗滌細胞2次,按凋亡試劑盒避光染色15 min;利用流式細胞儀對樣本進行檢測,數據用FlowJo V10軟件進行分析。

1.2.4qRT-PCR法檢測DKMG細胞的GFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA表達 將DKMG細胞按“1.2.3”項下分組給藥處理24 h,按總RNA提取試劑盒操作流程,提取Con組及低、中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞的總RNA。測定各組總RNA濃度,并反轉錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA);qRT-PCR反應體系為2×Green qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L上下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、加無核酸酶水至20 μL,95 ℃ 60 s預變性,95 ℃ 15 s變性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸、循環45次,利用GAPDH管家基因進行歸一化處理,并通過2-ΔΔCt法進行數據統計。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測DKMG細胞的EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白表達 取“1.2.3”項下分組給藥處理24 h的各組DKMG細胞,加RIPA裂解液,提取Con組及低、中、高濃度黑骨藤組細胞的總蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白濃度,變性;取各組蛋白20 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;恒壓25 V轉膜30 min,BSA封閉3 h,加一抗EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3多克隆抗體(稀釋度為1∶1 000);β-actin單克隆抗體(稀釋度1∶2 000);4 ℃層析柜中孵育12 h,回收一抗,1×TBST洗膜5次、5 min/次,室溫孵育二抗(稀釋度1∶2 000)2 h;1×TBST洗膜5次,5 min/次;PVDF膜上均勻滴加ECL Plus超敏曝光液,顯影,Quantity分析蛋白灰度值,以目的蛋白與管家基因β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 數據統計分析

2 結果

2.1 細胞存活率

結果顯示,與Con組比較,經低、中及高濃度黑骨藤組處理后的DKMG細胞存活率降低,且呈濃度依賴性(P<0.05);與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組U87MG細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與低濃度黑骨藤組比較,P<0.05;(3)與中濃度黑骨藤組比較,P<0.05。

2.2 DKMG細胞凋亡率

結果如圖2所示,與Con組比較,低、中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞凋亡率逐漸增加(P<0.05),且呈劑量依賴性改變。

2.3 EGFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA的表達

結果如圖3所示,與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表達呈濃度依賴性降低(P<0.05或P<0.01),但Bax mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 EGFRvⅢ、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白的表達

蛋白表達實驗結果表明(圖4),中,與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中EGFRvⅢ蛋白表達降低(P<0.05);中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞中Bax蛋白和Bax/Bcl-2蛋白比值表達升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中Cleaved caspase-3蛋白及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05),Caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。

注：A為各蛋白電泳結果,B為EGFRvⅢ蛋白表達,C為Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2蛋白表達,D為Caspase-3、Cleaved caspase-3及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表達;(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與低濃度黑骨藤組比較,P<0.05;(3)與中濃度黑骨藤組比較,P<0.05。

3 討論

EGFR家族中,EGFRvⅢ是最容易出現的突變型[23]。它是一種分子量為145 kDa的糖蛋白,由于缺乏胞外富含半胱氨酸的CR1和L1亞結構域,EGFRvⅢ不存在配體結合的區域,但能發生自體二聚體化而被激活[24]。作為組成型激活突變體,EGFRvⅢ會促進惡性腫瘤的發展,使其成為卵巢、乳腺及神經膠質等惡性腫瘤治療的研究熱點[25]。目前,靶向EGFR細胞外結構域的單克隆抗體及阻斷受體細胞內磷酸化的小分子激酶抑制劑,已被臨床批準上市,盡管兩類EGFR抑制劑初始緩解率較高,但大多數患者最終會出現耐藥[26-27]。因此,以EGFRvⅢ為靶標的藥物逐步進入市場,且針對EGFRvⅢ靶點研制出嵌合抗原受體T細胞免疫、EGFRvⅢ抗體、EGFRvⅢ小分子抑制劑及EGFRvⅢ介導相關疫苗等多種治療藥物[28]。

研究表明,EGFR表達異常與惡性腫瘤細胞放射敏感性、轉移、增殖、血管形成等密切相關,且與腫瘤發生、發展緊密關聯,其中EGFRvⅢ對腫瘤的預后具有重要作用[29]。抑制EGFRvⅢ能夠降低腫瘤細胞的增殖和致瘤性,從而促進腫瘤細胞的凋亡,這可能與EGFRvⅢ所激活的凋亡信號通路有關[30]。EGFRvⅢ被激活后,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達上調,促使Bax二聚體解離,生成Bax/Bcl-2二聚體增多,從而抑制細胞凋亡[31]。為探討黑骨藤對過表達EGFRvⅢ的DKMG細胞及不表達EGFRvⅢ的U87MG細胞的相互作用,本研究從細胞毒性等方面驗證了其作用機制。本研究首先采用了MTS法測定細胞活性,研究黑骨藤對DKMG細胞及U87MG細胞活力的影響,結果顯示低、中及高濃度黑骨藤可呈濃度依賴性殺傷DKMG細胞,但對U87MG細胞的毒性無影響;流式細胞術結果表明,各濃度黑骨藤能促進細胞凋亡,提示黑骨藤可能通過調控EGFRvⅢ對DKMG細胞產生細胞毒性,從而發揮治療作用。

體內環境的動態平衡,一方面在于細胞的毒性作用,而另一方面在于細胞的凋亡過程[32]。在細胞的凋亡過程中常有多種蛋白酶及凋亡基因參與其中,從而促發了細胞凋亡信號通路,最終導致細胞凋亡[33];Caspase家族參與其中,活化的Caspase-3在凋亡級聯反應中至關重要,其可降解DNA損傷修復酶,從而導致細胞凋亡[34];同等重要的Bcl-2蛋白家族中,凋亡信號調控與抑制細胞凋亡的Bcl-2、Bcl-XL蛋白及促進細胞凋亡的Bad、Bax蛋白等水平高低密切關聯[35]。本研究qRT-PCR結果顯示,與Con組比較,各濃度組黑骨藤可降低DKMG細胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表達,對Bax mRNA表達無影響;Western blot結果表明,與Con組比較,各濃度黑骨藤組可降低DKMG細胞中EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達,提高Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達。

綜上所述,黑骨藤對高表達EGFRvⅢ的DKMG細胞具有細胞毒性,主要是通過降低EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達,上調Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達,從而促進細胞凋亡,進一步發揮抗腫瘤活性。