外周血IL-38、CD247蛋白及CD247mRNA表達對類風濕關節炎患者疾病發展的評估價值*

周琴,蔣紅梅,孫廣,張海龍,席敏,張云東*

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院,貴州 貴陽 550025; 2.安順市人民醫院 檢驗科,貴州 安順 561000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、全身性自身免疫性疾病,其主要特征是關節滑膜增生、炎性細胞募集、血管翳形成、軟骨破壞和骨侵蝕等,最終導致關節畸形和功能喪失[1]。目前RA的診斷依據2010年美國風濕病協會(american college of rheumatology,ACR)和歐洲風濕病聯盟(european league for rheumatism,EULAR)提出的RA評分系統和分類標準[2],存在一定的誤診和漏診率,尤其對臨床癥狀不典型的RA患者更為不利。白細胞介素-38(interleukin-38,IL-38)是IL家族中的一種受體拮抗劑細胞因子[3],有研究表明IL-38與炎癥性自身免疫性疾病存在相關性,例如銀屑病關節炎、系統性紅斑狼瘡及RA等[4]。T細胞受體CD3ζ鏈(cluster of differentiation 247,CD247)是T細胞表面受體-CD3復合物(T cell receptor-cluster of differentiation 3 complex,TCR-CD3)中的zeta鏈,參與TCR-CD3復合物的組裝[5],對T細胞的激活起重要作用;CD247的表達已被證實與多種自身免疫性疾病相關[6],基因芯片篩選結果表明,CD247 mRNA與RA存在相關性[7-8]。有關RA患者外周血IL-38、CD247表達的相關研究較少,因此,本研究擬檢測RA患者外周血中IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA表達,并與實驗室特征進行相關性分析,評估IL-38、CD247在RA疾病中的診斷性能。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2021年12月—2022年5月就診的RA患者56例,要求符合ACR和EULAR提出2010年RA評分系統和分類標準[9],排除伴有嚴重感染和惡性腫瘤疾病的患者、不能配合研究完成相關評分量表者及妊娠期婦女。同時收集其他風濕免疫性疾病[痛風8例、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)5例、骨關節炎(osteoarthritis,OA)3例、干燥綜合征(sicca syndrome,SS)2例及系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)5例]患者23例作為非RA組和健康體檢者12例作為健康對照(healthy control,HC)組。3組研究對象均知情同意,本研究已通過醫院倫理委員會批準(〔2023〕安市醫倫理專1號)。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料 收集3組受檢者年齡、性別、體質量指數(body mass index,BMI),記錄RA組患者病程,檢測RA組和HC組受檢者C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)等實驗室指標。

1.2.228個關節疾病活動性評分(disease activity score-28,DAS28)[10]評估RA疾病活動度 采用DAS28評分評估RA組患者治療前的疾病活動度,評分越高表示病情越嚴重。根據DAS28評分將RA疾病活動度分為緩解期(DAS28<2.6)和活動期(2.6≤DAS28),其中活動期包括低(2.6≤DAS28<3.2)、中(3.2≤DAS28≤5.1)及高疾病活動度(DAS28>5.1)。

1.2.3酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清IL-38、CD247的表達 抽取HC組、RA組與非RA組治療前及RA組患者治療后空腹外周血4 mL,4 000 r/min離心10 min,分離血清備用;用ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)檢測IL-38、CD247的表達。

1.2.4RT-qPCR法檢測外周血單個核細胞(PBMC)中CD247 mRNA的表達 抽取RA組患者治療前與HC組檢測日的EDTA-K2抗凝空腹全血3 mL,用全血單個核細胞分離液(北京索萊寶公司)分離全血中的PBMC,置于EP管內,按照TriQuick總RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)提取PBMC中的RNA,標記后置于-80 ℃冰箱中備用;提前取上述RNA提取液恢復至室溫,按照TaKaRa PrimeScript TM RT試劑盒(北京寶日醫生物技術有限公司)純化RNA,逆轉錄為cDNA;用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TIi RNaseH Plus)試劑盒(北京寶日醫生物技術有限公司)于羅氏4800擴增儀(上海羅氏診斷有限公司)上檢測CD247 mRNA的相對表達,檢測結果用2-ΔΔCt表示,引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般臨床資料

RA組患者DAS28評分平均3.89±1.58分,病程為3.25(1.13,8.00)年。如表2所示,3組受檢者性別比較,差異有統計學意義(P<0.05);3組受檢者年齡、BMI比較,差異無統計學意義(P>0.05);RA組與HC組受檢者CRP、ESR比較,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 RA組、對照組和非RA組被檢者的一般資料

2.2 外周血IL-38、CD247蛋白及mRNA表達

如圖1所示,RA組患者IL-38表達高于HC組、非RA組(P<0.05),RA組患者CD247蛋白表達低于HC組(P<0.05),與非RA組比較、差異無統計學意義(P>0.05);RA組患者CD247 mRNA表達低于HC組(P<0.05)。

注：(1)與HC組比較,P<0.05;(2)與RA組比較,P<0.05。

2.3 RA活動度程度與IL-38、CD247蛋白及mRNA表達

結果顯示(圖2),隨著疾病活動度的升高,RA組患者IL-38表達逐漸升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與RA中低疾病活動度組、HC組及緩解RA組比較,RA高疾病活動度組患者外周血CD247蛋白和 mRNA表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。

注：(1)與HC組比較,P<0.05;(2)與RA低疾病活動度組比較,P<0.05;(3)與RA中疾病活動度組比較,P<0.05;(4)與RA高疾病活動度組比較,P<0.05。

2.4 IL-38、CD247蛋白及mRNA與RA患者疾病活動度、CRP及ESR的相關性

RA患者外周血IL-38 mRNA表達與疾病活動度程度呈正相關(r=0.716,P<0.001),CD247蛋白及mRNA與疾病活動度程度呈負相關(r=-0.512,P<0.001;r=-0.362,P=0.006);RA患者外周血IL-38 mRNA表達與CRP及ESR mRNA呈正相關(P<0.05),CD247 mRNA表達與CRP mRNA呈負相關(P<0.05)。見表3。

2.5 活動期 RA患者治療前后外周血中IL-38及CD247蛋白表達

活動期RA患者治療前外周血IL-38蛋白表達較治療后下降(P<0.001),CD247蛋白表達較治療后升高(P=0.007,表4)

表4 活動期RA患者治療前后外周血IL-38和CD24蛋白的表達

2.6 IL-38、CD247蛋白及mRNA診斷RA的效能

ROC分析結果顯示,RA患者IL-38、CD247蛋白及mRNA的ROC曲線下面積分別為0.841、0.702及0.758(P<0.05),IL-38診斷效能優于CD247蛋白及CD247 mRNA;聯合檢測分析顯示,IL-38+CD247 mRNA聯合診斷效能最佳,曲線下面積(AUC)為0.882,檢測敏感性為66.1%,特異性為100%。見表5及圖3。

注：A、B及C分別IL-38、CD247及CD247 mRNA單獨診斷結果,D為IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA聯合診斷結果。

表5 IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA對RA的診斷效能評價

3 討論

RA是一種全身性自身免疫性疾病,除了導致關節畸形和功能喪失外,還會帶來一系列的關節外的表現,包括類風濕結節、肺部血管受累以及全身合并癥等[11]。研究表明,IL-38、CD247在RA患者中的表達異常[12-13],故本研究旨在驗證RA患者外周血中IL-38、CD247的表達及其與臨床特征、實驗室指標的相關性,并評估其作為RA潛在生物診斷標志物的潛力。

有學者認為,由T淋巴細胞介導的炎癥細胞浸潤及其產生的炎癥細胞因子是RA發病的中心環節[14],而T細胞功能的激活依賴其表面的T細胞受體(T cell receptor,TCR)-CD3復合物,CD247作為TCR-CD3復合體組裝、表面表達和信號級聯所必需的蛋白[15],很大可能參與了RA疾病的發生發展過程中。本研究結果表明,RA患者CD247、蛋白及mRNA的表達低于健康人群,并在低、中、高疾病活動度人群中呈現逐漸降低趨勢。其可能機制為:RA中抗炎因子即Treg細胞可減少T細胞的激活,從而抑制CD247的表達水平有關[16]。進一步分析CD247與不同疾病活動度的相關性表明,CD247與RA疾病活動度呈負相關(r=-0.512,P<0.001),提示CD247可用于評估RA患者的病情嚴重程度。同時,治療后CD247表達升高,緩解期RA患者表達可基本恢復至健康人群水平,表明CD247可用于評估治療效果。

與CD247結果相反,本研究結果顯示,IL-38在RA組外周血中的表達水平高于HC組及非RA組,在高活動期病人中呈現高表達,經治療后降低,其表達增高可能為RA發生后刺激機體免疫系統產生的保護效應。多項研究表明,IL-38是一種抑制炎癥的細胞因子,在RA中起到保護骨關節、抑制滑膜細胞增生的作用[17]。IL-38可能通過核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路抑制脂多糖/Toll樣受體4(Lipopolysaccharide/Toll-like receptor 4,LPS/TLR4)誘導的炎癥,減輕RA的炎癥反應;還可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen ativated protein kinase,MAPK)信號通路,減輕RA的炎癥反應[18]。裴冰等[19]對RA試驗動物模型膠原誘導關節炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠注射IL-38干預后,降低了輔助性T細胞17(T helper 17,Th17)細胞分泌的促炎因子量、升高了Treg細胞分泌的抗炎因子量,重新恢復Th17/Treg平衡,從而減輕RA疾病的發病與病情的惡化。然而,Mora等[20]也提出IL-38在高濃度條下會喪失抑炎作用,甚至發揮促炎因子的作用。本研究結果表明,RA患者經治療后外周血中IL-38的表達水平較治療前下降,緩解期RA患者IL-38的表達水平與健康對照組的表達無差異,表明IL-38可評估RA患者的治療效果。此外,ROC曲線分析結果表明,單獨診斷時,IL-38對RA具有較高的臨床診斷價值;聯合診斷時,IL-38聯合CD247 mRNA檢測對RA的診斷有一定的價值。

綜上所述,本研究IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA參與到RA疾病的發生發展中,并且IL-38可能是RA疾病診斷的一個潛在生物診斷標志物。