生姜治療阿爾茨海默病作用機制網絡藥理學分析?

王 斌，曾慶濤，王雅樂，黃 海，許 苗，吳紅彥

深圳市羅湖區中醫院，廣東 深圳 518000

生姜Acorus tatarinowii Schott，為天南星科屬干燥的根和莖。主產于四川、浙江、江蘇。秋冬二季采挖，除去須根及泥沙，《神農本草經》［1］中，被列為上品，曬干，生用，“主風寒濕痹，咳逆上氣，開心孔，補五臟，通九竅，明耳目，出音聲。”藥性：辛、苦，溫。歸心、胃經。功能：開竅豁痰，醒神益智等。現代藥理研究發現，生姜具有改善記憶、認知的功能［2］。因此，探究其改善記憶、認知的機制，可更深層次挖掘其潛在的藥用價值。

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種慢性、進行性、衰退性不可逆轉的神經性系統疾病［3］，主要表現為認知、記憶力下降等癥狀，全球大約有5000 萬老年人因AD 生活質量受到嚴重影響［4］。據報道全球癡呆癥經濟成本，包括直接醫療、直接社會部門和非正規醫療費用預計到2030年將增至2萬億美元［5］。

AD發病機制尚未闡明，1992年哈代和希金斯［6］首次提出了淀粉樣級聯假說的病因β-淀粉樣蛋白。目前認為，β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）的沉積與Tau 蛋白過度磷酸化有一定關聯，包括炎癥、免疫、神經元死亡和特異性神經遞質減少等相關病理過程［7］。近年來，藥物治療主要以膽堿酯酶抑制劑為主［8］，但效果不理想。因此，探尋高效低毒藥物已成為AD領域亟需解決的熱點問題之一［9］。

英國藥理學家Hopkins 2007 年提出的“網絡藥理學”，以系統生物學、基因組學、藥理學、轉錄組學等為基礎［10］。可從分子、生物、基因網絡角度系統地、全方位、多層次地揭示中藥治療疾病的機制［11］。本研究通過構建藥物-靶點-AD 網絡圖，較直觀呈現出藥物、靶點和疾病之間的關聯性，并進行相關系統分析［12］，旨在更深層次探究生姜防治AD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 生姜活性成分及作用靶點獲取和篩選利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［13］，檢索“生姜”活性成分，并參考已報道文獻［14］，設置篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選生姜主要活性成分，并從知網、PubMed數據庫加以補充。運用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）［15］和數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），設置物種為“人類”，將靶點轉換為相應基因名稱。

1.2 AD 靶點網絡構建運用在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）等檢索AD靶點，以“Alzheimer's Disease”為關鍵詞，獲得AD 基因，整理剔除重復基因，收集AD 靶點。通過R 軟件將生姜活性成分和AD 靶點取交集，得到生姜治療AD的靶點，繪制韋恩圖。

1.3 藥物-靶點-疾病網絡構建運用Cytoscape［16］軟件（http：//www.cytoscape.org）中的插件“network analyzer”，對分子-靶點網絡特征參數進行分析［17］，圖中節點（Node）代表藥物與靶點；邊（Edge）代表藥物、靶點、疾病之間的關聯。

1.4 蛋白-蛋白互作網絡(protein-protein interactions，PPI)構建將生姜治療AD 的潛在靶點輸入STRING（https：//string-db.org）［18］中，限定物種為“Homo Sapiens”，獲取靶點，設置最低閾值，設為“medium confidence”，隱藏散在游離靶點，其他參數值設定為默認值，以txt文件保存，得到蛋白間網絡模型。運用Network Analyzer獲得中介度（betweenness centrality）和連接度（degree）等參數對模型進行預測分析［19］。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析運用Bioconductor生物包，通過R軟件，安裝相關生物包，便于分析GO 功能。ClusterProfiler 包是R 軟件基因數據分析包之一，可搜索Bioconductor 提供的GO功能和KEGG數據庫進行富集分析，其可視化功能特點突出。運用該軟件，以P＜0.05 為篩選條件，并將得到的結果可視化處理［20］。

2 結果

2.1 生姜活性成分及作用靶點通過TCMSP 篩選到生姜活性成分105個，潛在活性成分5個。見表1。

表1 生姜活性成分

2.2 生姜活性成分治療AD的潛在作用靶點共得到AD與藥物共同靶點60個，見圖1。

圖1 藥物與AD靶點交集圖

2.3 藥物-靶點-AD 網絡藥物主要活性成分與關鍵靶點的相互作用關系共33 個。通過Degree和BC 值大小，篩選核心靶點［21］，結果IL-6、Akt1、JUN、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT 等靶點是整個網絡的核心節點，揭示這些節點可能是生姜治療AD 的有效成分或靶點。見圖2、表2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

表2 藥物-靶點-AD網絡關鍵節點及其拓撲學特征

2.4 生姜治療AD關鍵靶點登陸STRING，導入生姜治療AD的靶點，將篩選條件設置為＞0.9，將單個游離的蛋白隱藏，得到PPI 圖。節點（node）共60個，平均值12.9，邊（edge）388 條。邊數（edge）越多，表示該節點（node）對應的靶點在網絡中的作用越重要［22］。通過R 軟件，收集靶點信息條形圖，結果Akt1、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT、IL-6、JUN 等蛋白度值較高，表明該蛋白作用顯著，也是其他蛋白互通的紐帶。見圖3—4。

圖3 關鍵靶點PPI網絡

圖4 關鍵靶點信息條形圖

2.5 GO 功能及KEGG 通路分析GO 揭示，生姜治療AD 的關鍵靶點排名前10 的生物學功能主要包括肽結合（12 個靶點）、酰胺結合（12 個靶點）、核受體活性（8 個靶點）、配體激活轉錄因子活性（8個靶點）、血紅素結合（8 個靶點）、四吡咯結合（8個靶點）、DNA 結合轉錄因子結合（8 個靶點）、RNA聚合酶II 特異性DNA 結合轉錄因子結合（7 個靶點）、泛素樣蛋白連接酶結合（6 個靶點）等，顯示生姜可通過調控多個復雜的生物信息學、基因組學以及抑制轉錄進程來治療AD。通過KEGG 分析獲得135 個通路，以P＜0.05 設置篩選條件，對核心KEGG進行分析，獲得5條主要信號通路，主要集中在AGE/RAGE（13個靶點）、TNF（12個靶點）、IL-17（9 個靶點）、C-type lectin receptor（10 個靶點）、Toll 樣受體（9 個靶點）等信號通路上。見圖5—6。

圖 6 KEGG富集分析

3 討論

本研究發現，beta-sitosterol、6-methylgin gediacetate 2、Stigmasterol、poriferast-5-en-3beta-ol、Dihy-drocapsaicin等為生姜主要活性成分。beta-sitosterol（β-谷甾醇）可降低逆轉APP/PS1小鼠海馬神經元興奮性突觸后電流頻率，表明β-谷甾醇可改善記憶、學習障礙及運動障礙，同時可能降低Aβ沉積［23］。有研究［24］發現Dihydrocapsaicin 可減少AD 活性氧和炎癥，提示辣椒素可通過調節活性氧和炎癥對APP的額外和潛在不良影響加工與加工β穩態，在體內對AD起防治作用。

活性氧介導的氧化修飾Akt1 有助于突觸AD的功能障礙，視為失去對突觸可塑性至關重要的活性依賴性蛋白質翻譯和維護，而促進突觸上Akt1-mTOR 信號傳導的治療策略可能提供新的治療方法，成為抗氧化酶疾病的治療靶點［25］。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）又稱為活化蛋白激酶，MAPK8 是MAPK 家族成員之一，又被稱為c-Jun 氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1），通過磷酸化并激活轉錄因子以進一步激活相應子蛋白1（activator protein-1，AP-1），促使下游相關基因表達，在細胞（分化、增殖、生存、死亡）、炎癥等病理發生、發展過程中起調控作用［26］。CASP3 又稱為半胱氨酸蛋白，是Caspase 蛋白家族中的成員之一，一般情況下是以非活化酶原形式存在，Caspase-3 一旦激活，將會引起神經系統相關疾病，如阿爾茨海默病、腦膜炎等［27］。

KEGG揭示，IL-17通路與炎癥的發生關系密切，IL-17 為受體家族，主要由IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC 等組成，研究發現AD 患者體內IL-17 表達升高［28］。Toll 通路又稱為（Toll-like receptors，TLR）TLR，是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類比較重要的蛋白質分子之一，同時也是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁，研究發現［29］Aβ可激活的小膠質細胞，將免疫監視模式轉化為免疫應答模式，使產生的IL-6、TNF-α及其他神經毒性因子，阻斷Toll信號通路，減少了相關促炎因子的產生。

綜上所述，通過網絡藥理學方法探究生姜治療AD的作用機制［30］，結果顯示涉及多個活性成分、靶標及多個相關通路［31］，與中藥治療AD 多靶點特點切合［32］，可為中藥藥效物質基礎及藥理機制研究提供新思路、新方法［33］。