甘草甜素對病毒性腦炎小鼠神經元活性及血清NSE 水平的影響

黃國玲，陳宗文，田秀英，陳紅兵

重慶大學附屬三峽醫院，重慶 404000

病毒性腦炎是一種較為常見的腦部感染疾病，多因急性病毒感染引起，多發于兒童時期。其癥狀多表現為體溫升高、嘔吐、頭部劇烈疼痛等，嚴重者伴有一定意識障礙，發病時易引起癲癇發作，并伴有一定的神經元凋亡［1-2］，需盡早發現并給予治療，否則會造成死亡或不可逆后遺癥。病毒性腦炎患者腦脊液中S-100B 蛋白和神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）含量較正常人偏高，因此該值變化對病毒性腦炎的診斷有重要價值，兩者常被用來作為評定腦損傷程度的指標［3-4］。甘草甜素是一種純天然甜味劑，從甘草中提取，具有抗炎、抗氧化等作用，具有良好的臨床應用潛力［5］，其抗炎、抗病毒作用能有效改善腦部水腫及炎癥反應，降低血液中的S-100B蛋白和NSE 含量，甘草甜素還具備抑制神經元凋亡的特性，從而改善神經元活性［6］。因此，本研究通過建立病毒性腦炎小鼠模型，探究甘草甜素對病毒性小鼠神經元活性及血清NSE水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物30只SD小鼠購自同濟大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2019-0007。健康雄性小鼠，鼠齡8 周左右，體質量20 g 左右，室溫24 ℃左右，自由采食攝水，在無壓環境下30只小鼠適應1周新環境。

1.2 試驗儀器甲酚紫(上海源葉公司，批號：S19196)；S100B（上海酶聯公司，批號：mlE1584)；Bax、Caspase-3 抗體（上海恪敏科技公司，批號：ab5714、bs-0087R），ELISA試劑盒(上海羽哚公司，批號：YLY1150)；E100 型光學顯微鏡(武漢愛斯佩科學儀器有限公司)；TUNEL 試劑盒(北京裕恒豐公司，批號：8088)。

1.3 動物模型建立及分組實驗動物隨機分為生理鹽水組、病毒性腦炎組和甘草甜素組。小鼠通過注射一定量的乙醚進行麻醉（進針點：右側眼角和耳根連線中點），生理鹽水組小鼠顱內注射生理鹽水20 μL，病毒性腦炎組及甘草甜素組小鼠顱內注射4.5×108pfu的柯薩奇病毒B3懸液20 μL，建立病毒性腦炎小鼠模型。甘草甜素組每天灌胃50 mg/kg 甘草甜素，生理鹽水組及病毒性腦炎組灌胃等劑量生理鹽水。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠行為能力 灌胃第1、7、14、21 天后，進行Morris 水迷宮試驗，讓小鼠在平臺中連續訓練4 天，每組小鼠每天進行2 次訓練，記錄每組小鼠找到平臺的時間。

1.4.2 神經元病理變化 甲酚紫（cresyl violet，CV）染色按常規焦油紫染色操作步驟進行CV 染色，光學顯微鏡下觀察海馬神經元病理學變化。

1.4.3 NSE 和S100B 檢測 經枕骨大孔穿刺緩慢抽取各組小鼠腦脊液150 μL，加入少量生理鹽水，制作各組腦脊液標本，按照試劑盒要求檢測星形膠質源性蛋白（S100B）及NSE。

1.4.4 小鼠神經元凋亡情況 取小鼠海馬組織石蠟切片，按照TUNEL 試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察，凋亡細胞陽性著色為棕黃色，計算神經元凋亡比例。

1.4.5 神經元內Bax、Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting 法，用裂解液裂解各組神經元，蛋白定量后行SDS-PAGE 凝膠電泳并轉移蛋白至PVDF膜。Bax、Caspase-3一抗4 ℃過夜孵育后加入HPR標記的二抗，37 ℃孵育1 h，采用凝膠成像系統ECL發光成像，分析各組條帶灰度值。

1.5 統計學方法采用SPSS 23.0 軟件分析數據，計量資料以xˉ±s表示，采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠行為能力3 組小鼠逃避潛伏期均隨灌胃天數的增加而減少，病毒性腦炎組逃避潛伏期長于生理鹽水組（P＜0.05），甘草甜素組逃避潛伏期短于病毒性腦炎組（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠逃避潛伏期 s

2.2 神經元病理變化生理鹽水組小鼠海馬組織呈均勻一致的紫藍色，細胞密度大且排列規則，神經元形態結構完整，細胞質染色清晰，胞核淡染，未見明顯神經元丟失；病毒性腦炎組小鼠海馬組織神經元皺縮，體積縮小，胞體溶解，胞核固縮、深染，核溶解，細胞密度變小，排列散亂、無層次，神經元丟失，具有凋亡特征；甘草甜素組小鼠海馬組織神經元損傷較病毒性腦炎組輕，細胞密度較大，排列較規則，形態較正常，核居中，核仁較清楚，可見斑點狀神經元變性和壞死，見圖1。

圖1 各組小鼠神經元病理變化（CV，×200）

2.3 NSE 與S100B各組小鼠NSE 與S100B 均隨灌胃天數的增加而降低，病毒性腦炎組NSE 高于生理鹽水組（P＜0.05）；甘草甜素組低于病毒性腦炎組（P＜0.05）。見表2—3。

表2 各組小鼠NSE變化

表3 各組小鼠S100B變化

2.4 大鼠神經元凋亡情況大腦皮層為細胞凋亡易發區，故本研究選取皮質進行細胞凋亡檢測，與生理鹽水組小鼠神經元凋亡率［（1.89±0.78）%］比較，病毒性腦炎組小鼠細胞凋亡率［（25.01±1.29）%］升高，甘草甜素組細胞凋亡率［（13.27±1.64）%］較病毒性腦炎組下降（P＜0.05），見圖2—3。

圖2 各組小鼠神經元凋亡情況（TUNEL，×2400）

圖3 各組小鼠神經元凋亡情況

2.5 神經元內Bax、Caspase-3蛋白表達生理鹽水組神經元細胞內幾乎無Bax、Caspase-3 蛋白表達，甘草甜素組Bax、Caspase-3 蛋白相對表達量低于病毒性腦炎組（P＜0.05），見圖4—5。

圖4 各組小鼠BAX、caspase-3蛋白表達情況

圖5 各組小鼠Bax、Caspase蛋白比較

3 討論

病毒性腦炎是一種常見的腦部疾病，一般由柯薩奇病毒所致，引起大腦血腦屏障異常，發生腦部水腫［7］，兒童為主要發病人群，起病急性或亞急性，臨床表現為惡心、全身無力等，病情較為嚴重者可能出現神經系統損傷［8-9］。控制腦水腫及顱內高壓是相對有效的措施。NSE 是一種可溶性胞漿蛋白，主要分布于神經細胞及神經內分泌細胞的胞漿中［10］。腦損傷后，神經細胞胞膜受到破壞，NSE 從細胞內進入細胞間隙，最后進入血液循環，使患者血液中NSE 水平升高［11］，升高幅度可作為腦損傷程度和范圍的評判。本研究通過注射柯薩奇病毒建立病毒性腦炎小鼠模型，探討甘草甜素對病毒性腦炎小鼠神經元活性及血清NSE 的影響［12-14］。

NSE 是糖酵解過程中的催化水解酶，是一種可溶性胞漿蛋白質，主要存在于神經元、神經纖維和神經內分泌細胞中，與神經元的分化、成熟有關。腦損傷時神經細胞受傷，其胞膜受到破壞，引發變性和崩解，對腦部產生傷害，神經元受到損傷，隨后NSE 被釋放入腦脊液和血液中進入血液循環，病毒性腦炎時患者血液中NSE 升高［15］，導致神經元細胞發生炎癥、水腫、壞死。患者血液中NSE 水平越高，則疾病嚴重程度越高，因此NSE 值通常作為評定病毒性腦炎引起腦部損傷的重要依據。本研究表明，甘草甜素能夠降低小鼠血液中NSE 值，其作用機制可能是因為甘草甜素水解產生的甘草次酸，可通過血腦屏障改善腦部水腫狀況，減輕炎癥反應，進而降低血液中NSE 值。甘草甜素對于因腦損傷導致的學習記憶能力衰退也有一定療效，本研究表明病毒性腦炎組小鼠逃避潛伏期長于生理鹽水組，甘草甜素組短于病毒性腦炎組。說明甘草甜素可改善病毒性腦炎大鼠NSE值及小鼠學習能力。甘草甜素，別名甘草酸，可分解出葡萄糖醛酸和甘草次酸，甘草酸須通過甘草次酸及葡萄糖醛酸發揮作用，分為GL、GA 兩種吸收形式，甘草甜素具有一定抗病毒作用［14］。本研究表明，病毒性腦炎組小鼠神經元細胞凋亡率高于生理鹽水組，而甘草甜素組低于病毒性腦炎組，說明甘草甜素對神經元細胞凋亡有一定抑制作用；有研究［16］表明，甘草甜素還具有一定免疫調節作用，其核心成分為苷元，能消除巨噬細胞活性，誘導淋巴細胞分泌淋巴因子，導致疾病進展。甘草甜素極性大，很難進入腦組織發揮作用，而其水解產生的甘草次酸可通過血腦屏障（星型細胞等組織）進入其中發揮藥效。甘草甜素對腦損傷有作用，能改善腦損傷小鼠學習記憶能力，對腦組織的保護作用機制主要表現為抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等方面。

本研究表明，病毒性腦炎組S100B 高于生理鹽水組，甘草甜素組低于病毒性腦炎組，其作用機制多為炎癥損害中樞神經系統，神經膠質反應性增生，重建這種自身穩定，在大、小膠質細胞增生的同時伴有S100B蛋白濃度改變；S100B蛋白分子量為21KD，是S100 蛋白家族中的一員，主要由膠質細胞合成和分泌，廣泛分布于哺乳動物神經細胞內，影響神經系統的生長發育，正常條件下不能通過血腦屏障，半衰期2 h，經腎臟清除，由神經膠質細胞合成和分泌，在腦損傷時通過急性膠質細胞反應增加其合成和分泌，參與損傷修復［17-18］。腦脊液S100B 蛋白濃度改變與病情相關，低濃度S100B 具有神經營養作用，高濃度伴隨一定的神經毒性作用，并可參與神經細胞凋亡作用。神經膠質細胞壞死后S100B 蛋白釋放和血腦屏障受破壞后通透性增高。有研究［19］表明，S100B 蛋白不僅反映神經細胞損傷，還是腦組織損害后一種追蹤生化標記物，對于疾病的診斷、病情變化監測及療效的判定都具有重要意義。

本研究發現生理鹽水組幾乎無Bax、Caspase-3蛋白表達，甘草甜素組Bax、Caspase-3 蛋白表達低于病毒性腦炎組。細胞凋亡又稱細胞程序化死亡，多種疾病均有可能導致細胞凋亡，由多種基因調控，常表現為生理性死亡。細胞發生凋亡有多種凋亡途徑，多數由Caspase 的活化啟動。Caspase-3 效應蛋白酶在凋亡過程中起關鍵作用，同時也是凋亡發生的標志［20］。Bax 為凋亡誘導蛋白，對凋亡有一定積極作用。當Bax以二聚體形式存在時，細胞色素C釋放，激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，促進細胞凋亡。甘草甜素能下調Caspase-3 表達，其原因是甘草甜素能降低GSK3β活性，活化的GSK3β作用于Caspase-3 分子，調控凋亡過程。這與本研究結果一致，因此甘草甜素可有效抑制細胞凋亡［20］。

綜上所述，甘草甜素對病毒性腦炎小鼠行為能力及神經元活性改善有一定積極作用，其作用機制可能與調控NSE、S100B、Bax及Caspase-3水平有關。