黃芪甲苷對高糖受損間充質干細胞生物學功能和分泌HGF 的影響?

羅玉清，梁文菲，張 熙，譚梅鑫，劉錦清，夏藝菲，朱芙蓉，熊 武△

1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007； 2 廣州中醫藥大學東莞醫院，廣東 東莞 523000；3 湖南省腦科醫院，湖南 長沙 410007； 4 湖南中醫藥大學臨床醫學院，湖南 長沙 410007；5 湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208

糖尿病是一類由多種因素引起的以長期血糖濃度升高為主要特征的慢性代謝性疾病，隨著社會經濟的不斷發展，人民生活水平不斷提高，糖尿病發病率逐年升高，且趨于年輕化［1］。目前研究表明高糖能誘發一系列氧化應激反應，從而對機體細胞造成損傷。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，具有高度增殖能力。有研究表明MSCs可在特定條件下誘導定向分化為內皮細胞并參與血管損傷部位的修復和再生，且能通過分泌肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）促進內皮細胞增殖、遷移和細胞外基質合成［2-3］。進一步研究發現高糖環境下MSCs 增殖、黏附、遷移和分泌等功能受損。黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗炎、促生長和抗應激等功效［4-5］。劉海萌等［6］研究發現AS-IV可增強骨髓來源MSCs，修復大鼠腦缺血再灌注損傷功能。然而AS-IV 能否改善高糖受損MSCs 功能，目前尚不確定。本研究旨在探討AS-IV對高糖受損人臍帶血MSCs生物學功能及其分泌HGF的影響，為AS-IV用于糖尿病及其并發癥的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑黃芪甲苷（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：S31401）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（中國南京凱基生物科技發展有限公司，批號：KGY002）；PBS 緩沖液、DMEM/F12 培養基（美國Hyclone 公司，批號：SH30256.01B、SH30023.01B）；胎牛血清、胰酶（美國GIBCO 公司，批號：10270-106、15050-057）；成脂誘導分化培養基、成骨誘導分化培養基、成軟骨誘導分化培養基（美國Cyagen公司，批號：RASMD-90031、HUXMA-90021、HUXUB-90042）；茜素紅染液、油紅O 溶液（美國Sigma 公司，批號：130-22-3RT、O1391-250ML）；阿利新藍染液（中國MesGen 公司，批號：MAS0981）；Cell Counting Kit-8（日本同仁公司，批號：CK04）；HGF ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：JL10756）。

1.2 主要儀器XD-101 型CO2培養箱（日本SANYO 公司）；5111918 型酶聯免疫檢測儀（美國Thermo Fisher 公司）；BX51 型生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；5804 型臺式低速離心機、5415R型4 ℃離心機（德國Eppendorf Centrifuge公司）；WH-2型振蕩器（中國上海滬西分析儀器廠）；YXQ-LS-50 型立式壓力鍋（中國上海博訊公司）；101AS-3 型電熱鼓風干燥箱（中國上海圣欣公司）。

1.3 方法

1.3.1 hUCBMSCs 培養 無菌條件下取足月健康新生兒胎盤臍帶血10 mL（標本采集獲產婦和家屬同意并簽署知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準，批準文號：HN-LL-GZR-201902），加入肝素抗凝，室溫下靜置30～60 min，取1.077 g/mL淋巴細胞分離液5 mL加入15 mL離心管中，將10 mL細胞懸液（臍帶血與PBS 液1∶1 混合稀釋）緩慢加入淋巴細胞分離液中。經密度梯度離心后取單個核細胞，移入含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM/F12 培養基中，37 ℃培養箱中培養7 天后傳代到第3 代凍存。將凍存的P3 代人臍血間充質干細胞（Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）進行細胞復蘇后，移入培養皿中，標明細胞名稱hUCBMSCs P4代，放入37 ℃培養箱中繼續培養。

1.3.2 hUCBMSCs 鑒定 將P4 代hUCBMSCs 凍存細胞復蘇，當細胞融合到80%左右時，使用胰酶消化，接種到明膠包被的24 孔板，每組設4 個復孔，置37 ℃，5%CO2培養箱中培養，當細胞融合到60%～70%時，分別按照人臍帶血間充質干細胞成骨、成軟骨、成脂肪誘導分化培養基試劑盒說明書要求，將細胞移入相應培養基中培養，每3天更換1次培養基，觀察細胞形態變化及生長情況，分別用茜素紅、阿爾新藍及油紅O 染色以確定細胞成骨、成軟骨、成脂肪染色效果。在熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.3.3 高糖受損hUCBMSCs 模型建立 將鑒定成功的hUCBMSCs用30 mmo1/L的葡萄糖在DMEM/F12培養基培養120 h，建立高糖受損hUCBMSCs 細胞模型。

1.3.4 黃芪甲苷最適濃度確定 將高糖受損hUCBMSCs 取對數生長期細胞胰酶消化，離心收集制成細胞懸液并鋪在24 孔板上，分別加入濃度為0、50、100、200、300、400 mg/L 的AS-IV 進行干預，培養48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，4 h 后參照CCK-8試劑盒說明書用酶標儀測定450 nm處的吸光度，并繪制增殖曲線圖以確定AS-IV 促hUCBMSCs增殖的最適濃度。

1.3.5 實驗分組及處理 將高糖受損hUCBMSCs隨機分為實驗組和模型組，實驗組用最適濃度AS-IV干預，模型組用等體積PBS液處理。并設置正常組，即正常hUCBMSCs（將鑒定成功的hUCBMSCs在5.5 mmo1/L 葡萄糖DMEM/F12 培養基中培養120 h）用等體積PBS液處理。

1.4 高糖受損hUCBMSCs 增殖能力參照CCK-8試劑盒說明書，取對數生長期細胞，使用胰酶消化后，離心收集制成細胞懸液，實驗組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS 液處理，48 h后各組均加入10 μL CCK-8溶液，4 h后用酶標儀測定各組細胞在450 nm 處的吸光度。

1.5 高糖受損hUCBMSCs 黏附能力將各組hUCBMSCs 細胞懸液鋪在24 孔板上，37 ℃、5%CO2條件下培養1 h，實驗組加入最適濃度AS-IV干預，模型組和正常組用等量PBS液處理，培養8 h后將各組hUCBMSCs 接種在含有大鼠纖維連接蛋白的培養板中，37 ℃下靜置30 min，隨機取2 個200倍視野計數貼壁細胞數目。

1.6 高糖受損hUCBMSCs 遷移能力實驗器械消毒滅菌后，用馬克筆在6 孔板背后每隔1 cm 劃橫線一道，橫線需橫穿過孔，同時每孔至少穿過5 條橫線。取對數生長期的hUCBMSCs 置于孔中，每孔約加入5×105個hUCBMSCs細胞，置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養過夜，再用無菌200 μL 槍頭在培養孔底部正中央劃一道痕跡，PBS液沖洗3次后去除脫落細胞。實驗組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS 液處理，培養48 h 后在生物倒置顯微鏡（200 倍）下測量0 h 和48 h 的劃痕面愈合情況。用遷移寬度表示細胞遷移能力。

1.7 高糖受損hUCBMSCs 分泌HGF 含量參照ELISA試劑盒說明書，實驗組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS液處理，48 h后取各組細胞上清液，在15 min內使用酶標儀測定450 nm的OD值。

1.8 統計學方法采用SPSS 24.0 軟件分析數據，計量資料以xˉ±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hUCBMSCs 培養光學顯微鏡下P3 代細胞邊緣清晰，形態均一，排列整齊，呈典型的長梭狀結構，排列呈漩渦狀。見圖1。

2.2 hUCBMSCs鑒定P4代hUCBMSCs成骨誘導分化后經茜素紅染液染色呈紅色結節沉積，經成軟骨誘導分化后阿利新藍染液染色呈藍色，經成脂誘導分化后油紅O 染液染色呈紅色，三者共同鑒定細胞為正常間充質干細胞。見圖2。

圖2 hUCBMSCs成骨、成軟骨和成脂肪誘導分化情況（熒光鏡，×400）

2.3 不同濃度AS-IV 對高糖受損hUCBMSCs 增殖的影響當AS-IV濃度在0～300 mg/L之間時，隨著AS-IV 濃度的增加，高糖誘導損傷hUCBMSCs 增殖OD 值逐漸增大，當AS-IV 濃度為300 mg/L 時，OD 值最大。當AS-IV 濃度為400 mg/L 時OD 值下降，隨后隨著AS-IV 濃度的增加增殖OD 值下降。因此，AS-IV 促高糖受損hUCBMSCs 增殖的最適合濃度是300 mg/L。見圖3。

2.4 最適濃度AS-IV 對高糖受損hUCBMSCs 生物學功能及分泌HGF 的影響與正常組相比，模型組高糖受損hUCBMSCs 增殖（OD 值）、細胞黏附數、細胞實際遷移寬度、分泌HGF 均下降（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組細胞增殖（OD 值）、細胞黏附數、細胞實際遷移寬度、分泌HGF增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞增殖、細胞黏附數、細胞實際遷移寬度與HGF比較

3 討論

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我復制和多向分化潛能的多能干細胞，存在于骨髓和其他組織器官中，可通過自我更新保持其細胞干性，因其具有高度增殖能力和多向分化潛能，是臨床干細胞療法中重要的細胞來源。目前研究表明在創傷修復方面，間充質干細胞不僅能向病變部位遷移并增殖分化成為成骨的種子細胞，直接參與損傷組織重建，而且能以旁分泌形式分泌大量生物活性因子間接參與修復［7］。有研究證實MSCs 可在體內或體外，經特定條件下誘導分化成為內皮細胞，從而參與血管損傷部位的修復和再生重建，并能通過分泌HGF 促進內皮細胞增殖、遷移［8］。HGF 在1984 年由Nakanura 等學者首次發現提出，它是一種多功能細胞因子，在全身各器官內均有表達［9］。間充質干細胞可通過旁分泌HGF 發揮促進細胞增殖、遷移和抗凋亡等作用［10-12］。齊文文等研究表明，人間充質干細胞分泌的HGF 可逆轉高糖誘導的足細胞凋亡和損傷，從而起保護足細胞作用［13］。然而在高糖環境下，MSCs 的生物學功能和分泌功能受到不同程度抑制［14］。畢見海［15］報道經高糖誘導培養MSCs 后，MSCs 的增殖、遷移、分化功能下降，細胞凋亡率上升。這與趙同平等［16］研究發現的高糖對MSCs 的增殖產生明顯抑制作用相吻合?？梢娙绾伪Ｗo高糖受損間充質干細胞，恢復其生物學功能和分泌功能，是MSCs 對創傷組織發揮修復和再生重建作用的關鍵。

AS-IV 是黃芪中最主要的活性成分，具有抗炎［17］、抗氧化［18］、抗細胞凋亡［19］及促生長［20］等功能。而AS-IV具有誘導MSCs向心肌樣細胞和神經細胞分化、促進MSCs 增殖以及抑制其凋亡的作用。趙靜苗等［21］證實AS-IV 體外可誘導大鼠骨髓來源的MSCs 分化為心肌樣細胞。李鵬濤等［22］證實AS-IV可體外誘導小鼠骨髓來源的MSCs分化為神經細胞，其機制可能與提高β-catenin 蛋白及其mRNA 的表達以及抑制Notch1 蛋白及其mRNA 表達有關。此外，何文涓等［23］證實一定濃度的AS-IV可使兔脂肪來源的MSCs 處于增殖期的細胞比例增加，處于靜止期的細胞比例減少。彭小娟等［24］證實一定濃度AS-IV 可以促進人骨髓來源的MSCs增殖，其作用機制可能與AS-IV 促進MSCs 對干細胞因子、血管內皮生長因子、基質細胞衍生因子的mRNA 表達有關。黃燦等［25］證實AS-IV 可抑制無血清及缺氧誘導的MSCs 凋亡，其機制可能與抑制線粒體膜電位降低有關。然而，AS-IV 能否恢復高糖誘導損傷MSCs功能，目前尚無相關報道。

本研究通過設計不同濃度梯度的AS-IV，干預高糖誘導損傷的人臍血MSCs，發現用300 mg/L AS-IV 處理高糖受損hUCBMSCs 促進體外增殖效果最強。用300mg/L AS-IV干預高糖受損hUCBMSCs，發現高糖環境可導致hUCBMSCs 增殖、黏附、遷移和分泌HGF 功能下降，而AS-IV 對高糖受損hUCBMSCs 具有保護作用，即AS-IV 干預下高糖受損hUCBMSCs 增殖、黏附、遷移和分泌HGF 功能恢復，其生物學功能和分泌HGF 功能甚至可以超過正常水平，這與中藥活性成分AS-IV 具有的“促生長”作用相關。可見AS-IV 具有保護高糖誘導損傷的hUCBMSCs 的作用，然其具體作用機制不明，有待進一步研究。同時，本實驗為體外實驗，仍存在一定局限性，需通過動物實驗進行進一步驗證。