基于炎癥與糖脂代謝探討連陳湯對肥胖小鼠體質量的影響?

王一涵，李佳睿，杜麗坤

1 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040

肥胖是由遺傳、環境等多因素引起的能量代謝紊亂，熱量攝入大于消耗所致的營養代謝性疾病。是誘發心血管疾病、高脂血癥、高血壓、多囊卵巢綜合征等疾病的重要危險因素［1］。肥胖的發病受遺傳、飲食、腸道菌群、炎癥因子等多方面影響［2］。病因雖未完全闡明，但肥胖作為一種慢性低度炎癥狀態被業界廣泛認可［3］。肥胖導致脂肪細胞因子合成異常，可激活炎癥信號網絡，分解過量游離脂肪酸入血，且脂肪組織前體轉化為類巨噬細胞，使炎性因子過度表達與釋放，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等［4-5］。研究表明發生胰島素抵抗（insulin resistant，IR）的重要原因之一是慢性低度炎癥的影響［6］，TNF-α、IL-6、MCP-1、C 反應蛋白（C-reaction protein，CRP）等都能導致細胞內炎性反應的發生，激活炎癥細胞因子信號，阻斷胰島素信號傳導，引發IR［7］。

本研究通過建立肥胖小鼠模型，應用連陳湯與辛伐他汀做對照實驗，觀察連陳湯對肥胖小鼠體質量、糖脂代謝、附睪脂肪組織的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究選用40 只SPF 級8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購于遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。實驗獲得黑龍江中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審批準許（2019071502）；飼養于黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心。

1.2 藥品來源藥品采購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院。連陳湯藥物組成：半夏15 g，黃連6 g，陳皮15 g，茯苓9 g，甘草5 g，加8 倍量水浸泡1 h，文火煎煮2次后合并藥液。藥液經四層紗布過濾后于70 ℃水浴鍋濃縮至含生藥0.38 g/mL，高壓滅菌后于4 ℃恒溫箱保存備用；辛伐他汀片（海正輝瑞制藥有限公司，國藥準字20010677，規格：20 mg）碾碎后用蒸餾水配制成混懸液保存于4 ℃冰箱中，藥物濃度為0.23 mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肥胖模型構建 實驗開始前所有小鼠適應性喂養1 周，給予普通飼料且單籠飼養。光照周期：12 h 光照/12 h 黑暗；飼養溫度：（25±1）℃；相對濕度：（60±5）%。實驗期間小鼠自由進食飲水。1 周后將小鼠隨機分為空白組10 只，予普通飼料飼養（黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供）；模型組、辛伐他汀組、連陳湯組各10 只予高脂飼料飼養（派克生物技術有限公司）。連續飼養4個月，每4周稱量小鼠體質量1次。高脂喂養小鼠體質量大于空白組體質量的20%即為造模成功。

1.3.2 給藥 給藥期間飼料喂養方式不變。給藥方式和計量：辛伐他汀組灌胃辛伐他汀混懸液［4.5 mg/（kg·d）］；連陳湯組灌胃連陳湯濃縮液［7.47 g/（kg·d）］；空白組與模型組灌胃等體積純凈水。每日1 次，連續4 周，給藥期間每周測量小鼠體質量1次。

1.3.3 標本取材 小鼠禁食12 h 后腹腔注射4%水合氯醛水溶液（10 mL/kg）麻醉小鼠，眼球取血，離心后取血清置于-80 ℃環境中保存備用。取血后的小鼠立即置于冰盒上，打開腹腔→剝離完整附睪脂肪組織→沖洗→濾紙吸干→稱重→記錄數據→置于4%多聚甲醛固定液中固定。

1.3.4 代謝指標檢測 使用全自動生化分析儀（日立高科技貿易上海有限公司）檢測血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）胰島素水平；尾靜脈采血測空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）；計算胰島素抵抗指數（homeostasis model of insulin resistance index，HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×空腹胰島素（fasting insulin，FINS）/22.5）；使用ELISA檢測試劑盒（哈爾濱市盈夏實驗儀器經銷部提供）檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.3.5 附睪脂肪組織HE染色 將4%多聚甲醛固定液中固定的附睪脂肪組織脫水→石蠟包埋→切片→脫蠟→復水→染色→脫水→透明→固封，待通風干燥后于光學顯微鏡下觀察小鼠附睪脂肪組織形態變化。

1.4 統計學方法應用SPSS 21.0 分析數據，計量資料以xˉ±s表示，若符合正態分布，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用tukey 法，不符合正態分布時釆用非參數檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量變化情況飼養16 周時，高脂飼料3組小鼠體質量均高于空白組（P＜0.01）。灌胃4周，空白組小鼠體質量無明顯變化；模型組小鼠體質量增加，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；飼養18周時辛伐他汀組小鼠體質量下降，但不如連陳湯組小鼠體質量下降明顯；兩組比較差異有統計意義（P＜0.05）；飼養17 周時連陳湯組小鼠體質量與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1、圖1。

圖1 各組小鼠治療前后體質量變化趨勢

表1 各組小鼠體質量變化情況（xˉ±s） g

2.2 小鼠糖代謝水平變化情況與空白組相比，高脂飼料3組小鼠FINS水平、HOMA-IR增高（P＜0.01）。與模型組比較，連陳湯組FINS 及HOMA-IR 水平降低（P＜0.01）；辛伐他汀組FINS及HOMA-IR下降不明顯（P＞0.05）。FPG水平模型組高于空白組（P＜0.01）；高脂飼料3組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠FPG、FINS及HOMA-IR比較（xˉ±s）

2.3 小鼠脂代謝水平變化情況與空白組比較，模型組小鼠血脂水平TG、TC 升高（P＜0.01）。與模型組相比，TC、TG 水平連陳湯組和辛伐他汀組均下降（P＜0.01），辛伐他汀組與連陳湯組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠TG與TC比較（xˉ±s） mmol/L

2.4 小鼠附睪脂肪組織變化情況空白組小鼠脂肪細胞形態規整；模型組小鼠脂肪細胞體積增大，細胞數量減少，脂滴含量較高；與模型組比較，連陳湯組脂肪細胞體積縮小，脂肪細胞數量增多，脂滴含量下降，辛伐他汀組小鼠脂肪細胞體積與細胞大小略減小但不明顯，脂肪細胞數量變化不明顯。模型組小鼠的附睪脂肪組織質量高于空白組，連陳湯組小鼠附睪脂肪組織質量較模型組降低（P＜0.01），脂肪積累減少，連陳湯組與辛伐他汀組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組小鼠附睪脂肪組織形態（HE，×400）

表4 各組小鼠附睪脂肪組織質量（xˉ±s）g

2.5 小鼠炎癥因子變化情況與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.01）；辛伐他汀組血清TNF-α水平降低（P＜0.05）；IL-6、IL-1β水平與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05），連陳湯組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較模型組降低（P＜0.01）；連陳湯組TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于辛伐他汀組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠炎癥因子水平比較（xˉ±s） pg/mL

3 討論

近年來肥胖的發生率逐漸增多且呈年輕化，成為危害健康的公共衛生問題，肥胖是攝入過多或消耗減少導致的脂肪大量累積，血脂代謝紊亂是引起代謝綜合征的重要因素之一，尤其內臟脂肪的增加與IR 的發生關系密切［8-9］。白色脂肪會不斷擴增，導致TNF-α、IL-6 等水平增高，引起全身性慢性低度炎癥狀態［10］。研究證實T2DM 的發生發展受肥胖影響，胰島素抵抗是致病的中心環節［11］。IL-6 在肥胖患者中主要由脂肪細胞分泌，具有促炎活性并使炎癥反應加重，降低胰島素信號轉導，引起IR［12］。TNF-α誘導IR 機制有減弱胰島素引起的葡萄糖跨膜轉運、升高血漿游離脂肪酸水平、干擾胰島素信號傳遞、抑制產生瘦素和脂聯素，使胰島素信號通路受損等［13-14］，TNF-α與IR程度正相關［15］。郭展宏等［16］研究認為肥胖狀態下炎癥因子、胰島素水平會增加，減重后FINS 水平、TNF-α和IL-6水平減低。喻松仁等［17］利用溫膽湯干預肥胖大鼠時證實控制體質量的同時TNF-α、IL-6、IL-17 水平會降低（P＜0.01）。吳騰飛等［18］應用苓桂術連湯治療肥胖伴IR，患者體質量降低的同時TNF-α、IL-2炎癥因子降低，HOMA-IR下降。

中醫理論下的肥胖最早記載于《黃帝內經》，《素問·奇病論篇》中有“喜食甘美而多肥”的記載，過食肥甘厚味是引起肥胖的因素。連陳湯以《太平惠民和劑局方》中二陳湯為基礎方加減而來，以健脾化濕，清熱滌痰為原則。方中君藥為半夏、黃連。半夏味辛能行散、性燥入脾胃，可消痰逐飲化痰濕；黃連燥濕化痰、除內郁痰熱，可制約本方溫燥之性；同時半夏配黃連有疏理氣機、辛開苦降之功；陳皮理氣健脾、燥濕化痰與茯苓健脾利濕使氣機得暢，有“治痰先治氣”之功；佐以健脾和中的甘草調和諸藥。本方配伍得當，共奏健脾化濕功能，起改善體脂、減重抗炎的作用。

本研究表明，高脂喂養的小鼠體質量增加（P＜0.01），其血脂（TG、TC）、炎癥因子（TNF-α、IL-6）、FINS 水平以及HOMA-IR 都有升高趨勢；附睪脂肪組織的重量也高于空白組（P＜0.01）；HE 染色的附睪脂肪組織可觀察到脂肪脂滴增加、形態不均、數量減少。而連陳湯組小鼠體質量下降（P＜0.01），血清TG含量降低（P＜0.01）、TC含量降低（P＜0.05）；TNF-α、IL-6、IL-1β水平及胰島素抵抗指數降低（P＜0.01）。說明連陳湯可縮小脂肪細胞體積，增加脂肪細胞數量，降低脂滴含量。可見連陳湯可以通過縮小脂肪累積、改善血脂紊亂、降低炎癥水平而改善IR。

研究表明連陳湯可改善肥胖患者中醫證候積分，改善或者臨床癥狀，降低體質量、BMI、腰圍并降低血清TG、TC、LDL-C 水平，改善患者脂質代謝紊亂［19］。連陳湯還可增加肥胖患者腸道菌群多樣性，降低厚壁菌門數量，升高擬桿菌門數目，這可能是連陳湯治療脾虛濕阻型肥胖的作用機制之一［20］。連陳湯可使TNF-α、Chemerin水平有下調趨勢可能是治療單純性肥胖的作用機制之一［21］。連陳湯可提高肥胖患者Omentin-1 水平、降低IL-6水平，改善FBG、FINS、HOMA-IR 水平，證實其可能通過降低血脂水平、減低慢性炎癥反應改善IR［22］。