正交-滿意度函數優化秦艽黃酮和環烯醚萜苷超聲共提取條件?

劉艷紅，侯敏娜，彭修娟，王 珊，王 青，許海燕

陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 西安 712046

秦艽始載于《神農本草經》，為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）、麻花秦艽（Gentiana stramineaMaxim.）、粗莖秦艽（Gentiana crassicaulis Duthie exBurk.）或小秦艽（Gentiana dahuricaFisch.）的根，為陜西道地藥材，其味辛、苦，性平，具有祛風濕、止痹痛、清濕熱、退虛熱的功效［1］。環烯醚萜苷類和黃酮類化合物是秦艽標志性化學成分，現代藥理研究表明，秦艽抗炎鎮痛［2］、保肝［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］等作用的發揮均與以上兩類成分有關。

目前，黃酮類化合物提取方法主要包括熱水提取法［6］、有機溶劑提取法［7］、堿溶酸沉法［8］、微波提取法［9-12］、超聲提取法［13-14］等，環烯醚萜苷類化合物提取方法主要包括溶劑提取法［15-16］、微波提取法［17］、超聲提取法［18］等，超聲提取法因其提取效率高、簡單快速、成本低等優點，在中藥材有效成分提取方法中占重要地位。本研究首次采用超聲提取秦艽中黃酮和環烯醚萜苷類物質，并探討其共提取最佳工藝條件，為秦艽藥材利用最大化提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥材秦艽（采摘于陜西省太白縣，經生藥教研室雷國蓮教授鑒定為龍膽科植物秦艽的根），蘆丁對照品（20170221）購于上海源葉生物科技有限公司，龍膽苦苷對照品（PY20150908AT）購于南京普怡生物科技有限公司。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純。

1.2 實驗儀器與設備AUY220 電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KW600DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 秦艽黃酮及環烯醚萜苷提取精密稱取秦艽粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，以一定料液比加入50%乙醇溶液。在一定溫度、功率下超聲處理一定時間，取出后，放冷至室溫，稱重，加50%乙醇溶液，補足減失重量，過濾，收集續濾液。

2.2 單因素試驗根據預試驗結果，設置乙醇體積分數（20%、40%、60%、80%、100%）、提取時間（20、25、30、35、40、45 min）、液料比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL）和提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）4個單因素，固定超聲功率100W、提取時間20 min、料液比1∶15及提取溫度 30 ℃，分別考察以上因素對秦艽黃酮及環烯醚萜苷提取率的影響，確定各因素影響和適宜參數范圍。

2.3 正交－滿意度優化設計依據單因素試驗數據，分析選取乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4 個因素。采用4 因素3水平分析，以黃酮和環烯醚萜苷提取率為響應值，優選最佳提取工藝，正交試驗因素與水平編碼設計見表1。

表1 因素水平

以秦艽黃酮和環烯醚萜苷的提取率為目標響應值，通過對多個單因素的優化獲得總體最優者。利用滿意度函數將每個響應值按公式（1）轉換為無量綱期望值di（0≤di≤1），d=0時說明滿意度不符合預期值；d=1 時說明滿意度達預期值；總體滿意度值取多個響應值的幾何平均值，即符合公式（2）。

公式（1）中，Yi（x）指第i 個指標的響應值，Ymin，i 指實驗數據中第i 個指標的最低響應值，Ymax，i 指實驗數據中第i 個指標的最高響應值；公式（2）中，Wi指第i個因子的權重，Wi滿足0＜Wi＜1，且，設秦艽總黃酮的提取率為Y1，總環烯醚萜苷的最大提取率為Y2；設定總黃酮最大提取率為2.57%，最小提取率為0，設定總環烯醚萜苷的最大提取率為9.51%，最小提取率為0。總黃酮和總環烯醚萜苷的權重均為0.5，即W1=0.5和W2=0.5。把響應值Y1和Y2轉變為總體滿意度值，利用正交設計助手軟件進行方差分析，通過響應值選出最大滿意度值所對應的反應條件即為共提取最佳條件。

2.4 工作曲線繪制

2.4.1 蘆丁標準曲線 精密稱取蘆丁對照品5.19 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度，即制得濃度為0.104 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。精密移取蘆丁對照品溶液1、3、5、7、9 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次編號為1、2、3、4、5，加入50%乙醇3 mL，加入5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉4 mL，搖勻，加蒸餾水溶解并定容至刻度。以不加蘆丁的試劑溶液為空白，用紫外-可見分光光度計在504 nm處測定吸光度值（A），以濃度（C）作為標準曲線橫坐標（x），吸光度（A）為標準曲線縱坐標（y），繪制標準曲線并得到線性回歸方程y=0.0182x+0.0055，相關系數R2=0.99909。見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.4.2 龍膽苦苷標準曲線 精密稱取龍膽苦苷對照品5.09 mg，置于25 mL 容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，即制得濃度為0.204 mg/mL的龍膽苦苷對照品溶液。精密移取龍膽苦苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次編號為1、2、3、4、5，加無水乙醇溶解并定容至刻度。以不加龍膽苦苷的試劑溶液為空白，用紫外-可見分光光度計，在272 nm 處測定吸光度值（A），以濃度（C）作為標準曲線橫坐標（x），吸光度（A）為標準曲線縱坐標（y），繪制標準曲線并得到線性回歸方程y=0.0345x-0.0182，相關系數R2=0.99868。見圖2。

圖2 龍膽苦苷標準曲線

2.5 單因素實驗結果及分析

2.5.1 乙醇體積分數對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5 份，每份1.0 g，根據“2.1”方法進行提取。設定料液比為1∶15 g/mL，提取時間20 min，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，乙醇體積分數為20%、40%、60%、80%、100%，探究乙醇體積分數不同水平下黃酮及環烯醚萜苷提取率。

當乙醇體積分數低于60%時，黃酮和環烯醚萜苷提取率呈上升趨勢；乙醇體積分數達60%時，秦艽提取率達峰值；但乙醇體積分數為60%～100%時提取率呈下降趨勢。原因可能與秦艽中黃酮或環烯醚萜苷的化合物相對極性有關，因乙醇體積分數升高，秦艽中黃酮或環烯醚萜苷類化合物溶出度降低，因此，選擇乙醇體積分數為60%。見圖3。

圖3 乙醇體積分數對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響

2.5.2 料液比對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末6 份，每份1.0 g，根據“2.1”方法進行提取。設置乙醇體積分數為60%，提取時間20 min，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL，考察在料液比為自變量情況下，秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率。

黃酮提取率料液比為1∶25 g/mL時達峰值；環烯醚萜苷提取率料液比小于1∶25 g/mL 時，隨料液比的增大而增高，料液比為1∶30 g/mL和1∶25 g/mL時提取率相差不大，料液比大于1∶30 g/mL 提取率降低，考慮到料液比的增加會造成提取劑的浪費，故選擇料液比為1∶25 g/mL。見圖4。

圖4 料液比對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響

2.5.3 提取時間對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末6份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設置乙醇體積分數為60%，料液比1∶25 g/mL，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，提取時間為20、25、30、35、40、45 min，探究在提取時間不同水平下，黃酮及環烯醚萜苷的提取率。

當提取時間為35 min 時，秦艽中黃酮和環烯醚萜苷的提取率達峰值。原因可能是時間的延長有利于溶劑與溶質反應，若過久則會損壞物質的組織結構，從而影響黃酮和環烯醚萜苷的提取率，所以最佳提取時間為35 min。見圖5。

圖5 提取時間對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響

2.5.4 提取溫度對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5 份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設置乙醇體積分數為60%，料液比1∶25 g/mL，提取時間35 min，超聲功率100 W，提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，考察在提取溫度為自變量情況下，秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率。

提取溫度為30～60 ℃時，秦艽中黃酮和環烯醚萜苷的提取率呈上升趨勢，當達到60 ℃時出現最大值，這可能是溫度的升高有助于提取劑對溶質的作用，60 ℃后呈下降趨勢，可能是因為生物活性被破壞，降低提取率，綜合考慮最適宜的提取溫度為60 ℃。見圖6。

圖6 提取溫度對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響

2.5.5 超聲功率對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設置乙醇體積分數為60%，料液比1∶25 g/mL，提取時間35 min，提取溫度60 ℃，超聲功率為100、200、300、400、500 W，探究在超聲功率為自變量情況下，秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率。

當超聲功率低于300 W 時提取率呈上升趨勢，300 W 之后呈下降趨勢，可能是超聲功率過高產生熱效應，導致黃酮和環烯醚萜苷類物質結構破壞，降低提取率，故應選擇超聲功率為300W。見圖7。

圖7 超聲功率對秦艽中黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響

2.6 正交-滿意度函數法優化運用正交-滿意度函數法對秦艽黃酮和環烯醚萜苷的提取工藝進行分析，秦艽提取工藝影響因素大小順序為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳工藝組合為A2B3C2D3，即乙醇體積分數60%，料液比1∶30 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間40 min。見表2—3。

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

2.7 驗證試驗按照上述最佳提取工藝，取秦艽藥材平行提取3 份。測定藥材中黃酮和環烯醚萜苷的含量，計算滿意度值。見表4。

表4 驗證試驗

3 討論

本試驗在單因素試驗的基礎上，采用正交-滿意度函數設計，優化秦艽黃酮和環烯醚萜苷提取工藝，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間對提取率的影響。結果顯示，乙醇濃度對秦艽黃酮和環烯醚萜苷提取率的影響具有顯著性，提取溫度、料液比、提取時間也對提取率具有影響，通過正交-滿意度函數優化得到的最佳工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶30 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間40 min。在此條件下，秦艽黃酮和環烯醚萜苷提取的平均滿意度值為0.997。選用滿意度值作為評價指標進行秦艽黃酮和環烯醚萜苷提取工藝優選，可部分消除各因素間的交互影響，所得提取工藝參數更加可靠。