高效液相色譜-串聯質譜法測定果汁中恩鐮孢菌素和白僵菌素

鄧 濤 ,吉小鳳 ,肖英平 ,汪 雯 ,呂文濤 ,王小驪 ,吳 振*,楊 華

（1.寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波 315832;2.浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所,浙江 杭州 310021）

我國是水果種植和消費大國,除鮮食外,還生產許多以水果為主要原料的加工產品(如果汁、果醬、果干、果粉等).果汁是以水果為原料經過物理方法處理得到的汁液產品.按照濃度可分為100%純果汁、高濃度果汁、低濃度果汁.但果品在加工、貯運等過程中極易發生真菌性病害,引起腐爛或腐敗,部分真菌還可能產生真菌毒素,對人體健康造成潛在危害.真菌毒素主要是由曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬等絲狀真菌在適宜條件下產生的次級代謝產物[1].恩鐮孢菌素(Enniatins,ENNs)和白僵菌素(Beauvericin,BEA)是近年來被報道的新型真菌毒素,也是鐮刀菌屬產生的次級代謝產物,主要污染谷物、水果及其相關制品等[2],其中常見的恩鐮孢菌素有恩鐮孢菌素A(EnniatinA,ENA)、恩鐮孢菌素 A1(EnniatinA1,ENA1)、恩鐮孢菌素B(EnniatinB,ENB)和恩鐮孢菌素 B1(EnniatinB1,ENB1)[1-2].研究調查表明,ENNs 和BEA 對人和動物具有遺傳毒性和細胞毒性,而且還有可能與其他生物毒素產生協同毒害作用,具體表現形式有激素紊亂、免疫抑制等[1-5].

現有文獻資料報道中,真菌毒素檢測常用方法有酶聯免疫法[6-7]、薄層色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜聯用法[10-11]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)[12-14]等,其中LC-MS/MS 因具有高通量、無需衍生化、靈敏度高、準確度高、抗干擾能力強等特點[12],已成為目前同時檢測多種真菌毒素的主流分析方法.由于食品基質組成成分復雜,因此樣品的前處理成為檢測實驗的關鍵步驟之一.真菌毒素檢測中常用的前處理方法有固相萃取技術[15-16]、液液萃取技術[17]、QuEChERS 方法[18-21]、加速溶劑萃取技術[21]等方法.QuEChERS 方法具有提取真菌毒素范圍廣、速度快、操作簡單等特點,在真菌毒素檢測方面應用廣泛[20].我國尚未制定果汁中恩鐮孢菌素和白僵菌素的標準檢測方法,因此建立一種簡單、快速、靈敏、準確的檢測方法具有重要意義.本文建立QuEChERS 前處理方法,同時結合超高效液相色譜-串聯質譜法對果汁中ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 進行檢測,以期為果汁產品中恩鐮孢菌素和白僵菌素污染篩查分析提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 均為標準品,奧地利RomeLab 公司;果膠酶(純度95%),美國Sigma Aldrich 公司;QuEChERS 填料包(分析純無水MgSO4、無水CH3COONa 和NaCl)、C18 吸附劑,山東美正生物科技有限公司;乙酸銨(質量純度≥99%),華東醫藥股份有限公司;分析純甲酸(體積純度≥88%),上海凌峰化學試劑有限公司;色譜純甲醇和乙腈,美國Merck 公司.

LC 30AD 超高效液相色譜儀,日本島津公司;AB SCIEX 6500 Qtrap 超高效液相色譜-質譜儀,美國AB SCIEX 公司;ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美國Waters 公司;KQ-250B 型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;BIOFUGE PRIMO R 型高速離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;微孔板振蕩器,維根技術(北京)有限公司;Milli-Q A10 超純水系統,美國Millipore 公司;0.22 μm 有機濾膜,北京頗賽科技發展有限公司.

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備

標準儲備液: 用乙腈將ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 標準品分別配置成100.0 mg·L—1的標準儲備液.置于-20 ℃下,避光保存,下同.

混合標準儲備液: 從100.0 mg·L—1的ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 標準儲備液中分別移取1 mL至100 mL的容量瓶中,用乙腈定容至刻度,混勻,配制成1.0 mg·L—1的混合標準儲備液.

標準系列工作溶液: 用V(甲醇):V(水)混合液(1:1)按比例稀釋混合標準儲備液,配制成質量濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L—1的標準系列工作溶液.配制基質空白標準系列工作溶液,則將V(甲醇):V(水)混合液(1:1)更換為本文前處理方法所制備的空白基質溶液,其余步驟不變.

1.2.2 樣品提取和凈化

在50 mL 離心管中準確稱取果汁樣品5.00 g(準確至0.01 g),依次加入200 μL果膠酶和25 mLV(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(79:20:1),常溫超聲提取30 min,置于多管漩渦振蕩器中振蕩提取5 min,加入QuEChERS 填料包(4 g 無水MgSO4、0.5 g 無水CH3COONa 和0.5 g NaCl),振蕩混勻1 min,高速離心5 min (8 500 r·min—1),準確移取1.5 mL 上清液于2 mL 的離心管中,加入100 mg C18 凈化,并渦旋震蕩30 s,然后高速離心3 min (12 000 r·min—1),取1 mL 上清液,0.22 μm 有機濾膜過濾后UPLCMS/MS 分析.

1.2.3 儀器條件

色譜: ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),柱溫40 ℃,流動相A 為甲醇,流動相B 為2 mmol·L—1乙酸銨水溶液,進樣體積為5 μL.梯度洗脫程序見表1.

表1 恩鐮孢菌素和白僵菌素的梯度洗脫程序

質譜: 電噴霧離子源(ESI);多反應監測(Multiple reaction monitoring,MRM);正離子掃描(ESI+);噴霧電壓(IS)5 500 V;離子源溫度(TEM)為500 ℃;氣簾氣(CUR)壓力為40 psi;霧化氣(Gas1)壓力為55 psi;輔助氣(Gas2)壓力為50 psi;離子源氣體為空氣,碰撞氣體為高純度氮氣(純度99.99%),該氣體由Peak Scientific(英國)氮氣發生器提供.

1.2.4 數據處理與結果計算

采用Multiquant V3.0.3 軟件和Microsoft Excel 2019軟件進行試驗數據分析,Origin 2018軟件繪制目標化合物的色譜圖.果汁中恩鐮孢菌素和白僵菌素含量按下式計算:X=ρV/m,式中:X為試樣中恩鐮孢菌素和白僵菌素的相對含量,μg·kg—1;ρ為從基質外標法定量中得到試樣測定液中恩鐮孢菌素和白僵菌素的質量濃度,μg·L—1;V為試樣測定液最終定容體積,mL;m為試樣質量,g.

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇及優化

2.1.1 色譜條件的優化

流動相選擇需與目標化合物的信號響應值、分離程度和離子化效果等因素密切相關.在ESI+模式下,水相中加入少量乙酸銨可以促進部分化合物的電離效果,提高靈敏度以及改善峰型等[22].本文以甲醇為有機相,比較2 mmol·L—1和5 mmol·L—1乙酸銨水溶液作為水相時的分離效果,結果表明,當水相為2 mmol·L—1乙酸銨水溶液時,4 種恩鐮孢菌素和白僵菌素分離效果更好,響應值更高.

2.1.2 質譜條件的優化

分別配制濃度為1.0 mg·L—1ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 的標準溶液.全掃描模式下,當目標化合物的單標進入離子源內部后,進行一級質譜掃描,獲得目標化合物在質譜儀上的母離子和質荷比(m/z).隨后進行子離子掃描,調節不同數值的碰撞能量,選擇2 個豐度最高、最穩定的子離子為定性、定量離子.最后在多反應監測模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)下,優化去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)在質譜儀上的最佳參數.優化后的具體參數見表2.

表2 恩鐮孢菌素和白僵菌素質譜參數

2.2 樣品前處理方法優化

2.2.1 提取溶劑

經查閱文獻,水果類基質中真菌毒素的提取多以乙腈體系為主,加入適量的水可以促進有機溶劑在基質中的滲透,而酸的加入可以破壞基質中存在的糖和蛋白質等[13,23].在此基礎上,本文考察了V(乙腈):V(水)混合液(80:20)(混合液①)、V(乙腈):V(水):V(乙酸)混合液(79:20:1)(混合液②)、V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(79:20:1)(混合液③)、V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(78:20:2)(混合液④)以及V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(77:20:3)(混合液⑤)為提取液,研究對果汁中4 種ENNS和BEA 添加回收率的影響.實驗結果表明(圖1),5 種提取液對ENA、ENA1 和BEA 差異不顯著(P＞0.05),添加回收率88.3%～118.6%;混合液①對ENB 和ENB1 存在明顯基質干擾現象,添加回收率分別為125.5%和132.7%,且與混合液③、混合液④和混合液⑤對ENB 和ENB1添加回收率的影響差異顯著(P＜0.01).在混合液中加入酸后,ENB 和ENB1 的基質干擾現象得到抑制,其中混合液②使得2 種真菌毒素的添加回收率下降8.8%和4.3%,混合液③使得2 種真菌毒素的添加回收率下降21.6%和40.1%,顯示后者提取效果明顯優于前者.繼續增加甲酸濃度后,發現4 種恩鐮孢菌素和白僵菌素的添加回收率波動較小,即混合液③、混合液④和混合液⑤作為提取液,對其添加回收率影響差異不顯著(P＞0.05),添加回收率在92.6%～118.6%之間.因此,本文確定混合液③為提取溶劑.

圖1 提取溶劑對恩鐮孢菌素和白僵菌素回收率的影響(加標相對質量濃度100 μg·kg—1)

2.2.2 提取溶劑體積

提取溶劑體積與待測樣品之間的接觸面積、溶解和擴散程度等都與樣品基質中真菌毒素的提取效果間存在一定相關性.因此,本文比較了15、20、25 mL的提取溶劑體積對5 g 果汁樣品中4 種ENNS和BEA 的提取效果.實驗結果表明(圖2),提取溶劑體積對BEA 的提取效果呈上升趨勢,當體積為15、20、25 mL時,BEA 的添加回收率分別為68.5%、77.0%、102.7%.4 種ENNS在3 種提取溶劑體積下的添加回收率為99.2%～121.4%,差異不顯著(P＞0.05).最終確定提取溶劑體積為25 mL.

圖2 提取液體積對恩鐮孢菌素和白僵菌素回收率的影響(加標相對質量濃度100 μg·kg—1)

2.2.3 果膠酶用量

鑒于果汁中通常會存在懸浮的果膠固體,并且有部分果膠固體還會與真菌毒素相結合,造成難以被有機溶劑提取[24].但果膠酶可以將果膠和淀粉等復雜的多糖分解成簡單小分子,還能將真菌毒素從植物組織中釋放出來,提高提取效果.因此,本文比較150、200、250 μL 果膠酶用量對果汁中4 種ENNS和BEA 添加回收率的影響.實驗結果表明(圖3),3 種果膠酶用量對4 種ENNS的影響較小,添加回收率在92.6%～110.6%之間;但果膠酶用量為150 μL 時,BEA 添加回收率為72.8%,當果膠酶用量為200 μL 和250 μL 時,添加回收率增加了29.9%和35.1%,且與前者差異顯著(P＜0.01).最終選擇果膠酶用量為200 μL.

圖3 果膠酶用量對恩鐮孢菌素和白僵菌素回收率影響的影響(加標相對質量濃度100 μg·kg-1)

2.2.4 鹽析劑

QuEChERS 方法一般會加入鹽,通過鹽析作用去除提取溶劑中水分,降低有機相在水中的溶解度[20].本文以4 g 無水MgSO4+1 g NaCl、4 g 無水MgSO4+0.5 g 無水CH3COONa+0.5 g NaCl 為鹽析劑,比較2 種鹽析劑對果汁中4 種ENNS和BEA 添加回收率的影響.實驗結果表明(圖4),2 種鹽析劑對4 種ENNS影響較小,添加回收率為92.6%～112.6%;但4 g無水MgSO4+0.5 g無水CH3COONa+0.5 g NaCl 為鹽析劑時,BEA 的添加回收率為102.7%,比4 g無水MgSO4+1 g NaCl為鹽析劑時的BEA 添加回收率增加30.6%,且兩者之間差異顯著(P＜0.01).最終本文選擇鹽析劑為4 g無水MgSO4+0.5 g 無水CH3COONa+0.5 g NaCl.

圖4 鹽析劑選擇對恩鐮孢菌素和白僵菌素回收率的影響(加標相對質量濃度100 μg·kg—1)

2.2.5 凈化劑

由于食品基質的復雜性,QuEChERS 方法在樣品鹽析后,通常用石墨化炭黑、乙二胺-N-丙基硅烷和碳18(carbon 18,C18)等凈化劑去除色素、有機酸和果膠等雜質[20].因此,本文比較0、100、200、300 mg 的C18 凈化劑對果汁中4 種ENNS和BEA添加回收率的影響.實驗結果表明(圖5),未凈化的4 種恩鐮孢菌素和白僵菌素的添加回收率在67.3%～83.6%之間,存在明顯的基質干擾現象,且與加入100、200、300 mg 用量的C18 凈化后的添加回收率差異顯著(P＜0.01);C18 凈化后4 種恩鐮孢菌素和白僵菌素的添加回收率為92.6%～108.9%,基質干擾可接受,且100、200、300 mg 用量的C18之間差異不顯著(P＞0.05).最終本文選擇C18 凈化劑的用量為100 mg.

圖5 C18 用量對恩鐮孢菌素和白僵菌素添加回收率的影響(加標相對質量濃度100 μg·kg—1)

2.3 方法學評價

2.3.1 線性關系、檢測限和定量限

取空白果汁樣品,通過前處理方法得到基質溶液,配制0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L—1的標準系列工作溶液.以4 種ENNS和BEA 的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制基質匹配標準溶液校正曲線.實驗結果表明,ENA、ENB 和BEA 在0.1～200 μg·L—1與ENA1 和ENB1在1～200 μg·L—1范圍內線性關系良好,且線性相關系數(R2)均大于0.998 9(表3).以3 倍和10 倍信噪比確定果汁樣品中4 種ENNS和BEA 的檢測限(Limits of Detection,LOD)和定量限(Limits of Quantification,LOQ),而樣品檢測限和定量限分別為1.5μg·kg—1和5.0μg·kg—1(表3).

表3 恩鐮孢菌素和白僵菌素的線性關系、檢出限、定量限

2.3.2 加標回收率和精密度

按優化后的方法進行前處理,取空白果汁樣品分別添加5、25、100μg·kg—1相對質量濃度水平的ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 混合標準溶液,每個加標水平進行6 次平行試驗(n=6),連續3 d 進行測定,得到ENNS和BEA 的添加回收率、日內精密度和日間精密度,驗證結果見表4.由表4 數據可見,ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 的3 個濃度水平添加回收率在88.0%～114.1%之間,相對標準偏差(RSD) 在1.7%～11.7%之間.由此可見,本文建立的QuEChERS 方法滿足果汁中ENNS和BEA 的檢測要求.

表4 恩鐮孢菌素和白僵菌素的回收率和精密度

2.3.3 基質效應

基質效應(Matrix Effect,ME)是指樣品中存在的內源性物質或其他過程中產生的非目標化合物,在離子源中與目標化合物發生物理或化學反應,影響離子化效率,造成目標化合物響應值升高或降低的現象[25].本文以基質空白標準系列工作溶液和標準系列工作溶液校正曲線斜率的比值來評價基質效應.ME 值越接近1,基質干擾小;反之,基質增強或基質減弱[22].實驗結果表明,ENA、ENA1、ENB、ENB1 和BEA 的ME 值在74.0%～102.4%之間,其中ENB1 的ME 值為74.0%,存在一定的基質抑制效應,其余4 種真菌毒素ME 值在88.4%～102.4%之間,受基質效應的影響較小.因此,為減少基質抑制效應對實驗結果準確性的影響,本文采用基質外標法定量分析實驗結果.

2.4 實際樣品檢測

本文采用建立的QuEChERS 方法對市場中隨機抽取的30 份果汁樣品(如蘋果汁、桔梗梨汁、芒果汁、橙汁、番石榴果汁、菠蘿汁、香蕉蘋果汁、胡蘿卜蘋果汁、桑葚汁、梨汁、楊梅汁、荔枝果汁等)進行檢測分析.實驗結果發現,均未檢出4 種ENNS和BEA.

3 結論

本文對色譜條件、質譜條件、提取溶劑種類、提取溶劑體積、果膠酶用量、鹽析劑和凈化劑選擇進行了優化,建立了QuEChERS前處理方法,同時結合UPLC-MS/MS方法測定果汁中恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1和白僵菌素.本方法具有簡單、快速、回收率高,靈敏度高等特點,適用于果汁中恩鐮孢菌素和白僵菌素定性和定量分析,補充了水果類制品中多種真菌毒素的定量確證檢測方法.