核桃內種皮游離氨基酸呈味特征及其營養評價

彭佳佳，張小軍，田 鑫，楊燕君，段國鋒，高 鵬，劉群龍,

（1.山西農業大學園藝學院，山西晉中 030801；2.山西農業大學果樹研究所，山西太原 030031）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科核桃屬落葉喬木，是世界“四大干果”之一[1]。核桃仁含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素以及維生素E、核黃素等多種維生素，具有較高的營養價值，深受消費者喜愛[2-4]。游離氨基酸作為維持人體健康的營養成分之一，可被人體直接吸收利用，參與人體氮代謝和免疫調節作用[5-7]，也可與口腔中的味蕾結合產生酸、甜、苦、鮮或咸等滋味[8]。已有研究表明，具內種皮核桃仁中含有17 種氨基酸，且必需氨基酸占總氨基酸含量的1/3 左右[9-12]。楊永濤等[9]研究表明，具內種皮核桃仁氨基酸比例系數貼近全雞蛋蛋白模式，適合人體吸收，為優質蛋白來源。毛曉英等[10]研究表明，具內種皮核桃仁必需氨基酸含量高于聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織（FAO/WHO）推薦值，可作為營養食品添加到其它食品中以滿足人體對必需氨基酸的需求。具內種皮核桃種仁中藥用氨基酸含量較高，與枸杞中含量相近，可作為藥用價值較高的植物蛋白資源進行開發利用[11]。

核桃內種皮是包裹核桃種仁的一層種皮結構，占核桃仁質量的5%左右[13]，但在生產加工過程中常被廢棄，缺乏對其的合理開發利用。核桃內種皮含有豐富的維生素、礦物質、蛋白質和脂質等物質，營養價值較高[14-15]，其含有的酚類、氨基酸等物質亦可豐富核桃仁滋味。謝素雅等[15]研究表明，核桃內種皮含有16 種氨基酸，7 種必需氨基酸占氨基酸總量33.16%。目前，有關核桃內種皮氨基酸的呈味特性和營養價值評價的相關研究較少，且以單一品種為主[15]。為探究不同品種核桃內種皮游離氨基酸組成及含量差異，本研究通過對6 個品種核桃內種皮中游離氨基酸含量的測定，并分析其呈味特性和營養價值，以期為核桃副產物的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘農核1 號’、‘汾核2 號’、‘汾核4 號’、‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’共6 個核桃品種 山西農業大學果樹研究所核桃種質資源圃，樹齡15 年，每個品種選取6 株樹隨機組合為三組，每組2 棵樹，設3 個重復；17 種氨基酸標準品 色譜級，北京索萊寶科技有限公司；磺基水楊酸、鹽酸等試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Biochrom30+氨基酸分析儀 德國Biochrom公司；冷凍干燥機 美國GOLD-SIM 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 于2020 年9 月核桃果實成熟時，從植株的東、南、西、北4 個方向和樹冠內外隨機采集30 個核桃青皮顏色由綠色漸變為黃綠色、頂部出現裂縫且無病蟲害的果實帶回實驗室，脫青皮后打開堅果，用鑷子將核桃種仁和內種皮剝離，液氮速凍，再冷凍干燥后研磨成粉，-20 ℃干燥保存，待測。

1.2.2 游離氨基酸含量測定 稱取0.5 g 內種皮干粉于離心管中，加入5 mL 鹽酸（0.02 mol/L）于4 ℃冷藏過夜后12000 r/min 離心15 min。取1 mL 上清液加入1 mL 質量分數為4%的磺基水楊酸，充分混勻后用0.22 μm 的水系濾膜過濾到棕色進樣瓶。測定采用Biochrom 30+氨基酸分析儀測定，測定方法參照賀娜等[16]的方法，并計算必需氨基酸比例E/T 值、E/N 值、RAA 值、RCAA 值和滋味活性值（TAV）。其中E/T=（EAAs/TFAAs）×100，E/N=（EAAs/NEAAs）×100；RAA=內種皮中某種必需氨基酸含量/FAO/WHO 提出的含量；RCAA=內種皮中某種必需氨基酸的RAA/必需氨基酸RAA 的均值，TAV=C/T。式中，EAAs 表示必需氨基酸含量；TFAAs 表示游離氨基酸總量；NEAAs 表示非必需氨基酸含量；C 表示樣品中呈味物質含量；T 表示各氨基酸味道閾值。

1.3 數據處理

實驗結果采用Excel 2013 軟件對數據進行整理，SPSS 20.0 軟件進行方差分析、主成分分析、聚類分析和聚類結果作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種核桃內種皮游離氨基酸含量

6 個核桃品種內種皮中均含有17 種游離氨基酸（表1）。不同核桃品種內種皮總游離氨基酸含量為2673.86～3490.21 mg/kg，平均為2972.01 mg/kg。‘汾核2 號’含量最高，與其余品種差異明顯。‘京861’含量最低，最高值/最低值的比值為1.31。6 個核桃品種中必需氨基酸含量差異較小。‘汾核4 號’必需氨基酸與總氨基酸的比值（E/T）最高，為30.77%，‘京861’最低，為20.48%，平均值為25.07%。必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（E/N）中‘農核1 號’最高，為53.18%，‘京861’最低，為38.15%，‘農核1 號’和‘汾核4 號’內種皮中氨基酸比較接近WHO/FAO提出的理想蛋白模型（理想蛋白模型中E/T 在40%左右，E/N 接近60%）。內種皮中9 種藥用氨基酸（Leu、Lys、Met、Phe、Arg、Asp、Glu、Gly、Tyr）含量為1582.72～2188.88 mg/kg，占氨基酸總量的57.67%～68.23%，各品種中含量差異較大。因此，核桃內種皮的營養價值較高。

表1 核桃內種皮游離氨基酸含量（mg/kg）Table 1 Content of free amino acid in walnut pellicle (mg/kg)

由表1 可知，不同核桃品種內種皮中各游離氨基酸含量差異顯著（P<0.05）。Arg 在6 個品種間上差異最大，其在‘京861’中含量最高，是‘汾核4 號’（含量最低）的4.74 倍，Arg 是藥用氨基酸，有助于恢復免疫細胞的抗腫瘤能力，增強細胞免疫力[6]。‘汾核4 號’內種皮Leu 含量與其它5 個品種之間差異較小。Glu 為6 個品種內種皮中含量最高的氨基酸，占總量的26.23%～32.74%，這與在‘香玲’核桃[15]、新疆核桃[9,17]、山核桃[13]和漾濞大泡核桃[18]中的研究結果相似。Glu 作為一種興奮型神經遞質，與認知能力有關，對大腦中與學習記憶有關的神經元有重要作用[7]。內種皮中Asp 含量較高，其與Glu 共占游離氨基酸總量33.99%～46.20%。已有研究表明Glu和Asp 含量對蛋白質含量影響較大[17]，因此，Glu 和Asp 可能為影響內種皮蛋白質的主要游離氨基酸。內種皮中含量較高的氨基酸還有Thr、Cys 和Arg，與Glu 及Asp，5 種氨基酸共占氨基酸總量的77.02%～81.44%，為內種皮游離氨基酸的主要成分。

2.2 核桃內種皮RAA、RCAA 評價

內種皮中的必需氨基酸較WHO/FAO 氨基酸模式[9,11]中的標準偏小（見表2）。RCAA 值表示偏離標準模式的大小，RCAA>1 表示該必需氨基酸在內種皮中相對過剩，RCAA<1 表示該必需氨基酸在內種皮中相對不足，RCAA 為1 表示該必需氨基酸在內種皮中為理想平衡狀態，RCAA 最小的必需氨基酸為限制氨基酸。由表2 可知，內種皮中的第一限制性氨基酸為Leu，第二限制性氨基酸為Val，Thr、Ile 和含硫氨基酸在內種皮中相對過剩，表示核桃內種皮可以為人體補充豐富的Thr、Ile 和含硫氨基酸，與其它果蔬混合食用，可提高不同食物的利用效率。

表2 核桃內種皮必需氨基酸RAA、RCAA 值Table 2 RAA and RCAA values of essential amino acids in walnut pellicle

2.3 核桃內種皮中氨基酸的呈味特征分析

6 個核桃品種內種皮共檢測出鮮味氨基酸3 種（Glu、Asp、Lys）、苦味氨基酸6 種（Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg）、甜味氨基酸6 種（Thr、Ser、Pro、His、Gly、Ala）和芳香族氨基酸2 種（Tyr、Phe）。由表3 可知，‘汾核2 號’呈味氨基酸總量最高（3075.43 mg/kg），‘京861’最低（2344.48 mg/kg），‘汾核2 號’是‘京861’的1.30 倍。不同核桃品種中各呈味氨基酸含量存在差異，鮮味氨基酸是含量最高的呈味氨基酸，占呈味氨基酸總含量的41.77%～55.28%。除‘汾核2 號’和‘汾核4 號’外，其余品種的苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量，‘汾核2 號’和‘汾核4 號’中苦味氨基酸與其余品種均存在顯著差異（P<0.05），芳香族氨基酸為含量最低的呈味氨基酸且各品種間差異較小。綜上，內種皮中呈味氨基酸差異與核桃品種有關，鮮味氨基酸為內種皮呈味氨基酸含量最高，芳香族氨基酸為含量最低。

6 個核桃品種內種皮各呈味氨基酸TAV 值見表4。TAV 是表示樣品中呈味物質濃度與其味道閾值的比值，反映樣品中呈味物質的滋味強度，當TAV>1 時，表示該氨基酸對內種皮滋味影響較大；當TAV<1 時，表示其對內種皮滋味影響不大。由表4 可知，TAV>1 的呈味氨基酸主要為Glu（鮮味氨基酸）和Arg（苦味氨基酸）。6 個品種中Glu 的TAV值為2.34～3.81，均值為2.94，為影響內內種皮鮮味的主要氨基酸。同時，Glu 是黃花菜和蘑菇中鮮味的活性成分之一[19-20]。Glu 還具有掩蓋苦味的功效，可抑制味覺受體中Ca2+信號傳遞[21]，降低苦味氨基酸Ile 的強度[22]。‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’中Arg 的TAV 值為1.03～1.26，對該品種內種皮的苦味有重要影響。在課題組前期口感評價中，‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’苦味程度低于‘汾核2 號’和‘汾核4 號’[23]，與本研究結果存在差異，這可能與Arg 的特殊呈味性有關。天然物質中Arg以L 型存在，呈苦味，具有抑制苦味的特殊作用，可通過掩蓋/結合味覺上的苦味受體或與味覺中的Na+通道相互作用，降低對L-Ile、L-Phe 等苦味氨基酸和奎尼溶液苦味的感知[8,24-26]，同時Arg 可與單寧[27]、苯甲地那銨和對乙酰氨基酚相互作用[28]，降低苦味化合物的苦味強度。因此，Arg 對‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’的苦味作用為呈味抑制效應，它可能通過掩蓋苦味受體或與內種皮中苦味分子結合而造成內種皮中其它苦味物質苦味強度的減小。內種皮中大部分苦味氨基酸含量低于閾值，Lioe 等[29]研究表明Phe含量低于閾值時可增強其它氨基酸的甜味和鮮味，由此可見內種皮中低于閾值的苦味氨基酸增加其呈味的復雜性。時羽杰等[30]研究表明L-Leu 為核桃內種皮苦澀味差異代謝物，而本研究中各品種內種皮中L-Leu 含量均低于閾值，對內種皮苦味貢獻較小。這可能由于前者研究中所有試材為內種皮口感極具苦味的CZ-301 和無苦味且略帶甘甜的CZ-64，本研究中6 個品種核桃內種皮都具有不同程度的苦味，故L-Leu 對內種皮苦味影響差異與核桃品種有關。

表4 核桃內種皮呈味氨基酸TAV 值Table 4 TAV values of flavor amino acids in walnut pellicle

2.4 不同品種核桃內種皮氨基酸含量的主成分分析

對6 個品種內種皮中17 個游離氨基酸含量進行主成分分析，可使各主成分含義更加明確。初始因子載荷矩陣進行旋轉后共提取出4 個特征值大于1 的主成分（見表5），方差貢獻率依次為31.95%，23.73%，22.20%，18.72%，累計方差貢獻率為96.59%，高于閾值85%，因此4 個主成分可以代替17 個指標對內種皮游離氨基酸進行分析，主成分線性關系分別為：

表5 游離氨基酸主成分特征值和貢獻率Table 5 Eigenvalue of the principal components and cumulative contribution rates in free amino acid

由表6 可知，PC1 在Lys、Asp、Cys、Glu 和Tyr 有較高的載荷，均高度正相關，表明PC1 對內種皮的非必需氨基酸影響最大，稱為非必需氨基酸因子。PC2 中Met 和Val 載荷值分別為0.87 與0.99，且存在正向影響，可稱為必需氨基酸因子。PC3 中Leu、Thr 和Ser 載荷較大，并與PC3 呈正相關，可稱為甜味氨基酸因子。PC4 的方差貢獻率最低，其中Ile 和Ala 的特征向量值較高，為正值，可稱為苦-甜味混合氨基酸因子。4 個主成分從營養和滋味方面反映了核桃內種皮游離氨基酸的綜合品質，以每個主成分對應的方差相對貢獻率作為權重建立綜合評價模型F=0.33F1＋0.25F2＋0.23F3＋0.19F4，最終獲得6 個核桃內種皮綜合質量分值及排名（表7），從高至低的排序為‘汾核2 號’、‘農核1 號’、‘汾核4 號’、‘金薄香8 號’、‘薄殼香’、‘京861’。其中‘汾核2 號’綜合得分最高，為0.69，表明其氨基酸綜合質量水平較高，‘京861’得分最低為-0.74，表明其氨基酸綜合質量水平較低；‘薄殼香’和‘京861’因子綜合得分為負值，表明其氨基酸綜合質量水平低于平均水平。結果表明，營養成分因子PC1 和PC2 對內種皮中氨基酸的綜合質量影響較大。因此，營養成分因子PC1 和PC2 對內種皮中氨基酸綜合質量影響較大，‘汾核2 號’為氨基酸綜合質量水平較高的品種。

表6 游離氨基酸主成分載荷矩陣與系數Table 6 Principal component load matrix and coefficient of free amino acid

表7 核桃內種皮中游離氨基酸成分得分和綜合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive assessment of free amino acid in walnut pellicle

2.5 核桃內種皮游離氨基酸的聚類分析

依據核桃內種皮中游離氨基酸的含量，采用pearson 相關性測定了6 個核桃品種的組間連接距離，得到樹狀聚類圖（圖1）。6 個核桃品種可劃分為兩大類，第一類為‘薄殼香’、‘金薄香8 號’、‘農核1 號’和‘京861’，該類核桃內種皮中苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值大于1，且‘薄殼香’和‘金薄香8 號’最先進行第一階聚類，該階聚類的2 個品種中苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值、氨基酸總量和必需氨基酸含量均相差較小；‘農核1 號’的苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值與第一階聚類的2 個品種的平均比值之間差距較小，進行第二階聚類，‘京861’的苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值與第一階聚類的2 個品種的平均比值差距較大，則為第三階聚類；第二類為‘汾核2 號’和‘汾核4 號’，其苦味氨基酸含量與甜味氨基酸含量的比值小于1，且必需氨基酸和鮮味氨基酸含量均高于第一類。因此，‘汾核2 號’和‘汾核4 號’為滋味品質和氨基酸營養價值較高的品種。

圖1 不同核桃品種內種皮游離氨基酸的聚類圖Fig.1 Cluster of free amino acid in different walnut pellicle

3 結論

核桃內種皮中游離氨基酸差異明顯，各品種游離氨基酸含量為2673.86～3490.12 mg/kg，Glu、Asp、Thr、Cys 和Arg 為內種皮游離氨基酸的主要成分，占游離氨基酸總量的77.02%～81.44%，其中Glu 含量最高，占總量的26.23%～32.74%。藥用氨基酸為內種皮中差異較大的組分之一，占游離氨基酸總量57.67%～68.23%，因此，核桃內種皮具有較高的藥用價值，可依據其藥理作用進行合理開發利用。必需氨基酸含量為547.71～885.14 mg/kg，不同品種間差異較小。Leu 是內種皮第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸為Val。

內種皮中呈味氨基酸模式與核桃品種有關，鮮味氨基酸為含量最高的呈味氨基酸，芳香族氨基酸含量最低，除‘汾核2 號’和‘汾核4 號’外，其余品種苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量。經TAV 計算，6 個品種中Glu 的TAV 值為2.34～3.81，對內種皮鮮味貢獻最大。‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’中Arg 的TAV 值為1.03～1.26，對內種皮苦味有貢獻，具呈味抑制作用。

本研究明確了‘農核1 號’、‘汾核2 號’、‘汾核4 號’、‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’6 個品種核桃內種皮游離氨基酸主要成分，證實了必需氨基酸、藥用氨基酸和呈味氨基酸組分在不同品種中存在差異。但研究中所選用試材品種較少，后續研究將再此基礎上擴大品種數量，對核桃內種皮氨基酸組分進行深入研究，以期篩選富含藥用氨基酸的特異種質，提高核桃經濟價值。