D-α-生育酚醋酸酯復配物對D-半乳糖致衰老小鼠的改善作用

闞緒甜，陳煒莉，李家旭，何文江，丁劉剛，黎 攀，杜 冰，李文治,

（1.無限極（中國）有限公司科研中心，廣東廣州 510623；2.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

衰老是機體內細胞、組織、器官漸漸衰退的生物學過程，這個過程往往伴隨著一些并發癥，如阿爾茨海默癥、心血管疾病等[1]。迄今，關于衰老機制的理論有自由基學說、基因學說、細胞凋亡學說、端粒學說等，其中被人們認可和研究最多就是自由基學說[2]。當自由基的產生和抗氧化系統之間的平衡被破壞，會引起氧化應激和炎癥反應的發生，從而導致衰老和疾病[3]。核因子-E2-相關因子（Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是氧化還原動態平衡和細胞解毒反應的主要調節者，通過激活幾種抗氧化劑和解毒酶的基因轉錄，如醌氧化還原酶1（Quinone oxidoreductase 1，NQO-1），血紅素氧合酶1（Hemeoxygenase1，HO-1）發揮抗氧化作用，從而起到抗衰老作用[4-5]。因此，尋找具有抗氧化及抗衰老作用的物質，并探究其作用機制是當前研究的熱點之一。

脂溶性維生素E 是一種天然抗氧化劑，可通過酯化反應，生成維生素E 酯化衍化生物，使維生素E 酯化衍生物既有維生素E 原有的生理功能，又比維生素E 更穩定[6]。天然形式的D-α-生育酚醋酸酯是目前常用的維生素E 酯化衍生物之一。美藤果油是從美藤果的果仁中提取出來的，含有很高的不飽和脂肪酸含量，具有良好的體外抗氧化性[7]。植物甾醇可提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）濃度，改善氧化應激[8]。蝦青素，一種類胡蘿卜素的含氧衍生物，具有很好的體外抗氧化和提高抗氧化酶活性的能力[9]。大量研究表明，多種抗氧化劑的合用，能形成一個氧化-還原體系，其抗氧化能力明顯高于單一的抗氧化劑[10]。王娜等[11]研究發現維生素E 和白藜蘆醇聯合應用會有明顯的抗氧化協同增效作用。Tang 等[12]研究發現α-生育酚、γ-谷維素和植物甾醇的抗氧化能力隨復配濃度的增加而增加。僅使用單一抗氧化劑不容易對機體的抗氧化系統產生全面的作用，因此采用多種抗氧化劑聯合應用漸漸成為抗氧化研究新趨勢。

鑒于此，本研究通過對比D-α-生育酚醋酸酯復配物的抗氧化和抗衰老效果，從而得出最佳的D-α-生育酚醋酸酯復配物，為抗衰老的相關研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然油脂復配物+植物甾醇（按小麥胚芽油：美藤果油：紅花籽油：蝦青素油：植物甾醇的比例為70:20:5:1:2 制得）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇復配物（按D-α-生育酚醋酸酯：植物甾醇的比例為45:1混合而制）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇+蝦青素復配物（按D-α-生育酚醋酸酯：植物甾醇：蝦青素比例為90:2:1 混合而制）均由無限極（中國）有限公司提供；雄性SPF 級C57BL/6 小鼠 50 只，（18±2）g，生產許可SCXK（粵）2021-0041 南方醫科大學實驗動物中心；丙二醛試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）測試盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（Astaxanthin，AST）測試盒、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）測試盒、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）測試盒、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）測試盒 南京建成生物工程研究所 ANKE TDL-5-A 型離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Labserv K3 酶標儀、Evolution 300 紫外可見分光光度計、PIKOREAL96 熒光定量RCP儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外抗氧化實驗

1.2.1.1 DPPH·清除率 參照王肖行等[7]的方法，并略作修改。用乙醇將不同復配物、維生素C 稀釋成質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL 的溶液，取2 mL 不同質量濃度的樣品溶液于試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L 的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液，混勻，4000 r/min離心6 min，靜置30 min，用乙醇為參比組調零，在517 nm 處測定吸光度。按照以下公式計算清除能力：

式中：As為樣品吸光度；Ac為用無水乙醇替代DPPH 溶液的對照組吸光度；A0為用無水乙醇替代復配物樣品溶液的空白組吸光度。

1.2.1.2 ·OH 清除率 參照王鈺等[13]的方法修改，用乙醇將不同的復配物、維生素C 稀釋成質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL 的溶液，在試管中加入2 mL 配好的不同質量濃度的樣品溶液、6 mmol/L的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液，搖勻后靜置10 min，再加入6 mmol/L 的水楊酸2 mL，混勻，室溫避光靜置30 min，在510 nm 測其吸光度。羥基自由基（Hydroxyl radical，·OH）清除率按以下公式計算：

式中：As為樣品組吸光度；Ac為用蒸餾水替代水楊酸的對照組吸光度；A0為用蒸餾水替代復配物溶液的空白組吸光度。

1.2.1.3 Fe2+螯合能力 參考王寒等[14]的方法。用乙醇將不同復配物、維生素C 稀釋成質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL 的溶液，在試管中加入1 mL不同質量濃度復配物溶液，3.7 mL 蒸餾水、2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL 和5 mmol/L 的菲啰嗪溶液0.2 mL，振蕩搖勻，避光靜置10 min 后，5000 r/min離心10 min，取上清液在562 nm 處測定吸光度，Fe2+螯合率按以下公式計算：

式中：As為樣品組吸光度，Ac為用蒸餾水替代反應體系中的FeCl2的空白組吸光度，A0為用蒸餾水替代復配物的空白組吸光度。

1.2.1.4 總還原能力 參考邢海亮等[15]的方法，用乙醇將不同復配物、維生素C 稀釋成質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL 的溶液，利用三氯乙酸法測定總還原能力，在700 nm 測其吸光度。還原能力按以下公式計算：

式中：其中As為樣品組吸光度，A0為用乙醇替代復配物稀釋液作為空白組的吸光度。

1.2.2 衰老小鼠模型的抗氧化及抗衰老研究

1.2.2.1 衰老模型建立及干預 50 只SPF 級小鼠適應性喂養1 周后，按體重隨機分為5 組，每組10只。其中，陰性對照組（NC）小鼠每日于頸背處皮下注射等體積的0.9%生理鹽水；衰老模型組（SLM組）、天然油脂復配物+植物甾醇組（VEO 組）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇復配組（VEZ 組）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇+蝦青素復配組（VEX 組）小鼠每日于頸背處皮下注射300 mg/kg 的D-半乳糖，同時VEO 組、VEZ 組、VEX 組經口灌胃，給予劑量為1.7 mg/kg 體重的相應受試樣品，按照體重計算給藥體積（0.1 mL/10 g），連續6 周。

1.2.2.2 血清及肝臟組織的采集 實驗結束后，小鼠禁食12 h，使用1%巴比妥鈉（3.5 μL/g）麻醉各組小鼠，摘除小鼠眼球，用離心管收集小鼠血液，將收集好的血液，靜置2 h，然后3500 r/min 離心15 min，取上清液-20 ℃保存待測。采血后，即刻頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟，并將其在預冷的生理鹽水中漂洗，去除血液，用濾紙吸干表面水分，凍存備用。

1.2.2.3 抗氧化指標測定 根據GSH-Px 試劑盒、TAOC 試劑盒、MDA 試劑盒的說明書，測定血清中相應的指標。

1.2.2.4 血清炎癥因子測定 根據試劑盒說明書，測定IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子水平。

1.2.2.5 肝功能指標測定 根據試劑盒說明書，測定血清中AST、ALT 含量。

1.2.2.6 RT-qPCR 檢測Nrf2 通路中mRNA 的表達 參照胡麗麗等[16]的方法，取肝臟組織0.02 g，用Trizol 法提取組織總RNA，以組織總mRNA 為模板，逆轉錄cDNA，根據SYBR Premix EXTaqⅡ試劑盒使用說明配制反應體系，擴增條件為：預變性，95 ℃，10 min；擴增反應，95 ℃，15 s 和95 ℃，30 s，共40 個循環；溶解曲線分析在60～95 ℃。2-ΔΔCt法分析Nrf2 相對內參基因β-肌動蛋白（β-actin）的表達水平。PCR 引物由北京擎科有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2.7 Western Blot 檢測Nrf2 通路中蛋白的表達 剪取0.025 g 肝臟組織，用冰預冷PBS 洗組織，加入300 μL RIPA 裂解液于生物樣品均質儀中研磨，冰上裂解10 min；裂解結束后于4 ℃，12000 r/min離心15 min，取上清液進行蛋白定量。上樣20 μL 樣品進行電泳分離后，轉膜封閉；將膜與Nrf2、NQO-1、HO-1、β-actin 抗體一起室溫孵育60 min，4 ℃過夜；第2 d 室溫放置30 min，加入二抗孵育90 min 后，在ECL 化學發光液中顯色，利用凝膠圖像處理系統處理。

1.3 數據處理

所得實驗數據利用GraphPad Prism 9 軟件進行匯總、顯著性分析以及繪圖，數據用平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 則有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化能力

2.1.1 DPPH·清除率 DPPH·清除率常用來評估物質的抗氧化能力，該值越大，抗氧化能力越強[17]。由圖1 可知，質量濃度為1～5 mg/mL 時，VEO 組、VEZ組、VEX 組的DPPH·清除率分別從20.83%、16.08%、14.25%升高到58.86%、67.81%、63.18%；在5 mg/mL時，VEZ 組的清除率最高。

2.1.2 ·OH 清除率 ·OH 是活性氧的一種，具有極強的氧化性[13]。由圖1 可知，除VEX 組之外，其余復配物的·OH 清除率隨質量濃度的增加而升高，其中VEZ 組的清除率顯著優于VEO 組（P<0.001）。VEX組的·OH 清除能力在3 mg/mL 達到最大；在5 mg/mL時，VEZ 組的清除能力為67.48%，優于VEO 組和VEX 組。

2.1.3 Fe2+螯合能力 Fe2+離子具有強烈的助氧化能力，通過與過氧化氫（H2O2）之間的芬頓反應加速催化過氧自由基（·OOH）生成，誘導氧化反應的發生，而螯合劑可使Fe2+轉化為穩定的氧化形式Fe3+，從而抑制芬頓反應中自由基的產生，發揮抗氧化作用[18]。從圖1 可知，在質量濃度為1～5 mg/mL 范圍內，不同復配物的Fe2+螯合能力隨質量濃度的增加而升高，表現出比維生素C 的Fe2+螯合能力強的效果；其中VEZ組表現最佳，在5 mg/mL 時可達61.64%。

2.1.4 總還原能力 總還原能力指的是自由基接收到電子后轉化為穩定物質的能力，抗氧化能力隨總還原能力增強而增強[19]。由圖1 可知，在質量濃度為1～5 mg/mL 范圍內，不同復配物總還原能力隨質量濃度的增加而升高，當質量濃度高于3 mg/mL 后，VEZ 組的總還原能力更好。劉曉飛等[20]研究表明植物甾醇具有良好的抗氧化能力，這與本實驗結果相似。綜上，不同復配物中，VEZ 組的DPPH·清除能力、·OH 清除能力、Fe2+螯合能力、總還原能力較強。

2.2 衰老小鼠模型抗氧化結果

2.2.1 不同復配物對衰老小鼠體內抗氧化指標的影響 在正常生理狀態下，抗氧化系統負責清除組織中過多的活性氧（ROS），以保護機體免受氧化應激損傷，GSH-Px 是抗氧化系統中主要的抗氧化酶，負責把組織中的ROS 轉化為乙醇和水，以中斷過度氧化反應[21]。T-AOC 各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，是抗氧化系統功能狀態的綜合指標[22]。MDA 是脂質過氧化的重要降解產物之一，其含量的表達間接反映了活性氧對細胞和組織的損害程度[23]。

從圖2 可知，與NC 組相比，SLM 組的GSH-Px酶活力和T-AOC 活性分別顯著（P<0.001）下降了63.54%、45.00%，MDA 量顯著增加了70.60%（P<0.0001），這表明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功。與SLM 組相比，不同復配物的GSH-Px 酶活力都提高了，VEO 組、VEZ 組、VEX 組分別增加了34.28%、98.12%、170.49%；Min 等[24]研究表明向飼料中添加維生素E 能夠通過上調GSH-Px 基因的表達，發揮抗氧化能力，這與本研究結果一致。對于TAOC 活性，VEO 組、VEZ 組、VEX 組分別比SLM組增加了65.01%、70.18%、70.67%（P<0.01）；對于MDA 生成量，VEO 組、VEZ 組、VEX 組分別比SLM 組降低了56.04%、67.04%、64.04%（P<0.0001）。張露等[25]研究表明蝦青素預處理，使高糖作用下晶狀體上皮細胞的GSH-Px 顯著升高、MDA 顯著降低；李曉鈺等[26]研究表明植物甾醇能降低高脂飲食建立的非酒精性脂肪肝小鼠模型的MDA 上升。本研究發現，三組復配物顯著降低了D-半乳糖誘導的脂質過氧化產物MDA 的表達，并增加了GSH-Px和T-AOC 的抗氧化酶活性，說明三組復配物具有良好的抗氧化能力，對小鼠體內氧化應激損傷具有一定的改善作用。

圖2 不同復配物對小鼠體內抗氧化指標的影響Fig.2 Effects of different complexes on antioxidant indexes in mice

2.2.2 不同復配物對衰老小鼠血清中炎癥因子的影響 IL-6、IL-1β和TNF-α是參與炎癥反應的細胞因子，參與到各種炎癥反應與氧化應激中，當炎癥增加，IL-6、IL-1β和TNF-α均升高[27]。由圖3 可知，與NC 組相比，SLM 組血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量表現出顯著的升高（P<0.0001），通過不同復配物的干預后，均有所下降。與SLM 組相比，VEO 組、VEZ 組、VEX 組的IL-6 含量分別下降了4.45%、3.34%、1.76%，IL-1β含量分別下降了4.79%、1.96%、2.30%，TNF-α含量分別下降了9.99%、8.07%、13.71%。這與丁婷婷等[28]研究結果一致，表明三組復配物在一定程度上具有緩解D-半乳糖致衰老小鼠炎癥的能力。

圖3 不同復配物對小鼠血清中炎癥因子的影響Fig.3 Effects of different complexes on serum inflammatory factors in mice

2.2.3 不同復配物對衰老小鼠ALT、AST 含量的影響 氧化應激引發的肝功能破壞導致ALT、AST 等酶的釋放、脂質過氧化、抗氧化功能喪失以及活性氧的產生，因此ALT、AST 酶活性的大小可以用于衡量肝功能的受損程度[29-30]。從圖4 可知，與NC 組相比，SLM 組的ALT 和AST 水平顯著升高（P<0.0001），說明衰老導致了小鼠肝功能損傷。在不同復配物干預后，與SLM 組相比，VEO 組、VEZ 組、VEX 組的ALT 水平分別下降22.21%、25.96%、24.11%，AST水平分別下降了8.85%、12.75%、16.01%（P<0.01）。這與Li 等[31]研究結果相似，表明三組復配物有利于降低D-半乳糖致衰老小鼠的血清中AST、ALT 含量，以緩解衰老導致的肝損傷。

圖4 不同復配物對小鼠AST、ALT 活力的影響Fig.4 Effects of different complexes on AST and ALT activity in mice

2.2.4 Nrf2 通路的mRNA 和蛋白的相對表達量Nrf2 是機體在氧化應激損傷時重要的轉錄調節因子，對位于其下游靶基因的表達起活化作用，當出現氧化應激時，Nrf2 會激活下游NQO-1、HO-1 等基因的表達[32]。Nrf2 基因表達上調可能顯著改善衰老相關疾病或延緩衰老過程，HO-1 是體內負責把血紅素分解的誘導酶，NQO-1 能調節細胞的氧化還原電位水平，來發揮抗氧化作用[33-34]。由圖5～圖6 可知，與NC 組相比，SLM 組的Nrf2、NQO-1、HO-1 的mRNA 和蛋白相對表達量顯著下降（P<0.0001）。對于mRNA 表達水平而言，與SLM 組相比，VEO組、VEZ 組、VEX 組的Nrf2 表達水平分別上升了336.31%、749.80%、393.06%，NQO-1 的表達量分別上升了319.57%、668.94%、419.10%，HO-1 表達量上升了404.83%、727.48%、460.43%（P<0.0001）；對于蛋白表達水平而言，與SLM 組相比，VEO 組、VEZ 組、VEX 組的Nrf2 表達水平分別上升了42.6.67%、1093.33%、746.67%顯著上升（P<0.0001），NQO-1 的表達量分別上升了844.44%、1088.89%、1033.33%（P<0.0001），HO-1 表達量上升了1150.00%、1912.50%、1412.50%（P<0.0001）。這與李曉鈺等[28]、Sun 等[35]研究結果一致，說明通過給予D-α-生育酚醋酸酯復配物可能通過激活Nrf2 信號通路，減少氧化損傷，增加衰老小鼠下游靶基因NQO-1 和HO-1 的表達，能調節抗氧化酶活性，從而延緩衰老進程，并且在這不同D-α-生育酚醋酸酯復配物中，VEZ 組的效果最好。

圖5 Nrf2、NQO1、HO-1 的蛋白表達Fig.5 Protein expression of Nrf2,NQO1 and HO-1

圖6 Nrf2、NQO-1、HO-1mRNA 和蛋白的相對表達量Fig.6 Relative expression of Nrf2,NQO-1,HO-1 genes and proteins

3 結論

本研究通過測定不同復配物的體外抗氧化能力，并采用D-半乳糖致小鼠衰老模型評價復配物的抗衰老作用。結果顯示，三組復配物中VEZ 組的體外抗氧化效果較佳；與衰老模型小鼠相比，經過三組復配物干預后，小鼠體內GSH-Px、T-AOC 升高，MDA 生成量下降，從而改善氧化應激損傷，血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和肝功能指標ALT、AST 水平均下降；三組復配物干預后，Nrf2、NQO-1、HO-1 的mRNA 和蛋白相對表達量增強，其中VEZ組表達效果最佳。綜上所述，D-α-生育酚醋酸酯復配物能激活Nrf2 通路，增加NQO-1 和HO-1 的表達，提高抗氧化酶活性，降低脂質過氧化水平，來提升D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化應激能力增強抗氧化效果，從而延緩衰老進程，其中D-α-生育酚醋酸酯與植物甾醇復配的效果更佳。通過本研究結果將為D-α-生育酚醋酸酯復配物開發成為延緩衰老的食品提供實驗依據。