miR-93-5p對缺氧/復氧H9c2心肌細胞凋亡的作用機制研究

劉 斌,劉 娜,曹廣林

隨著生活方式的改變和生活節奏的加快,心血管疾病的發生率逐漸趨于年輕化。心肌缺血再灌注損傷造成的心肌細胞凋亡和線粒體功能障礙是心肌缺血再灌注病人發生心力衰竭的主要原因[1]。研究表明,降低炎癥反應和氧化應激水平可明顯減少心肌細胞凋亡,改善線粒體功能障礙[2]。miRNA是一種單鏈非編碼RNA,研究發現,多種miRNA參與調節心肌缺血再灌注損傷[3-5],miRNA-93-5p對膿毒癥造成的心肌損傷以及糖尿病腎病等具有保護作用[6-7]。本研究旨在探討miR-93-5p在缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 試劑及儀器

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;miR-93-5p陰性對照片段以及miR-93-5p mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司;miR-93-5p和U6的聚合酶鏈式反應(PCR)引物序列購自中國廣州銳博公司;兔抗大鼠活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specificproteinase-3,Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司;DMEM培養基購自北京華美試劑公司;超凈工作臺購自沈陽市醫療器械二廠;培養箱購自美國NAPCO公司。

1.3 分組及給藥

將H9c2心肌細胞接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養基中進行培養,置于37 ℃ 5%CO2的恒溫培養箱中孵育,當細胞融合度達到90%時,進行傳代。取第4代對數生長期的細胞用于實驗。將細胞分為對照組(control組)、H/R組、miR-93-5p陰性對照組(miR-NC組)、miR-93-5p模擬物組(miR-93-5p mimic組)。miR-NC組轉染miR-93-5p陰性對照片段50 μmol/L,miR-93-5p mimic組轉染miR-93-5p模擬物50 μmol/L。24 h后,除control組外,其余3組建立H/R模型。首先,將不含血清和糖的DMEM培養基用混合氣體(95%N2和5%CO2)平衡2 h制備飽和缺氧液,將心肌細胞中原有的培養液棄掉,加入飽和過的缺氧液,并放置在37 ℃含有95%N2和5%CO2的培養箱中培養10 h,建立缺氧模型。10 h后,棄掉缺氧液,加入含糖和10%胎牛血清的DMEM培養基,置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培養箱中,培養2 h,建立復氧模型。control組心肌細胞置于含糖和10%胎牛血清的DMEM培養基中培養,置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培養箱中孵育。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定miR-93-5p的表達水平

復氧結束后,棄去細胞培養液,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次,Trizol試劑完全裂解細胞,細胞裂解液用氯仿抽提,異丙醇沉淀后,收集總RNA。紫外分光光度計鑒定RNA濃度和純度。取1 μL樣品進行反轉錄,熒光定量PCR儀進行擴增,反應條件為95 ℃ 2 min;95℃ 30 s;58 ℃ 40 s;共40個循環。所有樣品均進行5次重復操作。以U6作為內參,采用2-△△Ct法計算miR-93-5p的相對表達水平。miR-93-5p的引物序列見表1。

表1 基因及引物序列

1.5 噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率

各組心肌細胞復氧結束后,MTT比色法檢測心肌細胞存活率。將細胞制成細胞懸液,接種于96孔板中,每孔3 000個細胞,每孔中再加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,37 ℃培養箱中孵育4 h。棄去上層清液后,每孔再加入200 μL的二甲基亞砜,振蕩孵育10 min后,放置在酶標儀上,設定波長為490 nm,測定A值,參照試劑盒說明書指定標準曲線,根據標準曲線計算心肌細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率

各組心肌細胞復氧結束后,胰酶消化細胞,PBS洗滌重懸,加入500 μL緩沖液混勻,取100 μL細胞懸液加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)孵育10 min,然后加入碘化丙啶(PI)孵育15 min。使用流式細胞儀和Flowjo軟件分析心肌細胞凋亡率。

1.7 氧化應激損傷指標檢測

各組心肌細胞復氧結束后,棄掉細胞培養基,收集細胞,冰浴中用超聲細胞粉碎儀處理30 s,之后,4 ℃下3 500 r/min離心10 min,收集上清。根據各試劑盒說明書,用紫外-可見分光光度計平行測定各組細胞裂解液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性,硫代巴比妥酸法測定MDA含量,二硫雙硝基苯甲酸定量法檢測GSH-Px活性。

1.8 ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達

各組心肌細胞復氧結束后,收集上清液檢測炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達。首先,用包被液稀釋包被抗原,最適濃度為5～20 μg/mL,450 nm波長處測定A值,根據說明書建立標準曲線,由標準曲線計算含量。反應板每孔各加入0.3 mL,37 ℃水浴2 h,棄掉包被液,加入洗滌緩沖液洗滌。每孔加入經稀釋過的待測上清液0.2 mL,37 ℃水浴2 h。洗滌后,每孔加入稀釋過的酶結合物0.2 μL,37 ℃水浴2 h。洗滌后,加入鄰苯二胺溶液0.2 μL,室溫靜置30 min,每孔加入0.05 μL終止液。酶標儀波長調至490 nm處,測量A值。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測心肌細胞中蛋白表達

各組心肌細胞復氧結束后,棄去上清液,預冷過的PBS洗滌各組細胞,各洗3次,加入50 μL的RIPA裂解液,置于冰上30 min,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。按照實驗分組依次加入各蛋白樣品20 μL,120 V恒壓電泳,直至溴酚藍達到凝膠底部,結束電泳。采用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,0.3 A恒流濕轉2 h,室溫封閉1 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)法顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 各組心肌細胞中miR-93-5p表達比較

各組miR-93-5p表達比較,差異有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組miR-93-5p表達降低(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組miR-93-5p表達升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組miR-93-5p表達升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌細胞中miR-93-5p表達比較

2.2 各組心肌細胞存活率比較

各組心肌細胞存活率比較,差異有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組心肌細胞存活率降低(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組心肌細胞存活率升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組心肌細胞存活率升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組心肌細胞存活率比較 單位:%

2.3 各組心肌細胞凋亡率比較

各組心肌細胞凋亡率比較,差異有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組心肌細胞凋亡率升高(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組心肌細胞凋亡率降低(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)。詳圖1、表4。

表4 各組心肌細胞凋亡率比較 單位:%

2.4 各組氧化應激指標SOD、MDA、GSH-Px水平比較

各組SOD、GSH-Px、MDA水平比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組SOD、GSH-Px水平降低,MDA水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組SOD、GSH-Px水平升高,MDA水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組氧化應激指標SOD、MDA、GSH-Px表達比較

2.5 各組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 單位:ng/L

2.6 各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較

各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達降低,Bcl-2蛋白表達升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表7、圖2。

圖2 各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達條帶圖

表7 各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

3 討 論

缺血再灌注時心肌細胞由長時間的缺血缺氧狀態到吸入大量的氧氣和營養物質,導致線粒體功能損傷,活性氧過度產生,氧化應激水平升高,誘導心肌細胞凋亡。心肌細胞損傷觸發炎癥反應,大量炎性因子釋放,進一步加重心肌細胞凋亡。過度的炎癥反應和氧化應激水平引起細胞凋亡、纖維化和細胞自噬[8-11],抑制炎癥和氧化應激水平可減少心肌缺血再灌注或H/R誘導的心肌細胞凋亡[12]。既往研究表明,miR-93-5p通過調節Toll樣受體4(TLR4)/髓分化因子88(MyD88)/核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路抑制脂多糖造成的炎癥反應,改善急性肺損傷[13]。本研究通過建立H/R心肌細胞模型,探討miR-93-5p對H/R造成的心肌細胞損傷的影響。

SOD和GSH-Px是廣泛存在于細胞內的一類抗氧化酶,線粒體損傷時,過度產生活性氧,使氧化應激水平升高,而GSH-Px可有效清除活性氧,保護線粒體結構和功能完整。SOD具有清除超氧陰離子的作用,保護細胞免受損傷,其活性的高低間接反映機體清除氧自由基的能力[14],而MDA水平則間接反映氧自由基對細胞損傷的程度。心肌細胞損傷觸發TNF-α的釋放,進一步刺激炎性因子的分泌,如IL-1β、IL-6、黏附分子等,而促炎因子的大量分泌,會進一步加重心肌損傷。在本研究中,心肌缺血再灌注時,SOD和GSH-Px活性降低,MDA水平升高,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,由于活性氧和氧自由基清除受到阻礙,以及促炎因子大量釋放,導致心肌細胞存活率降低、凋亡率升高。miR-93-5p參與調節多種生理過程,如高糖誘導的細胞增殖、遷移、纖維化及心肌細胞凋亡等[15-16]。為了探討miR-93-5p對H/R造成的心肌細胞損傷是否具有保護作用,采用miR-93-5p mimic孵育心肌細胞后,建立H/R模型。實驗結果顯示,miR-93-5p過表達增強SOD、GSH-Px活性,降低MDA以及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,心肌細胞存活率升高,凋亡率降低,表明,miR-93-5p通過降低氧化應激水平和炎癥反應,改善H/R誘導的心肌細胞損傷。

細胞凋亡受到促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的共同調控,兩類凋亡蛋白失衡,導致細胞凋亡發生。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶,在調節細胞凋亡的過程中發揮重要作用,其中Caspase-3位于凋亡級聯反應的關鍵位置,是重要的凋亡蛋白酶。Bcl-2家族同樣是調節細胞凋亡的重要家族,Bcl-2通過干擾細胞色素C的釋放,阻斷Caspase蛋白酶的激活,抑制細胞凋亡。Bax作為Bcl-2家族重要的促凋亡蛋白,其表達水平與細胞凋亡密切相關。Bax是線粒體膜上離子通道的組成部分,可以使細胞色素C穿過線粒體膜,激活Caspase-3,促進細胞凋亡[17]。本實驗通過蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白表達情況,H/R使心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達增加,Bcl-2蛋白表達降低,miR-93-5p過表達使Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達降低,Bcl-2蛋白表達升高。本實驗結果表明,miR-93-5p通過調節凋亡相關蛋白表達,抑制細胞凋亡。

綜上所述,miR-93-5p可有效抑制H/R誘導的細胞凋亡,可能是通過調節凋亡相關蛋白表達,抑制炎癥反應和降低氧化應激水平發揮作用,為臨床治療心肌缺血再灌注提供理論支持。