玉米黃酒發酵過程中微生物菌群結構與揮發性風味物質的相關性分析

郭建華,趙曉旭,蔣海嬌

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

中國黃酒是以谷物為原料,利用酒曲作為糖化發酵劑釀造而成的發酵酒。酒曲中含有多種微生物,包括酵母菌、霉菌和細菌[1-2]。黃酒的風味特點取決于多種微生物共同作用產生的風味物質,包括酯、高級醇、脂肪酸、醛、酚等[3]。對黃酒發酵微生物進行群落分析發現,優勢細菌菌群多為芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬[4-6],而優勢真菌菌群為曲霉屬[7]。唐鰻秋等[8]研究表明,黃酒發酵過程中葡萄球菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia為發酵前期的主要細菌菌屬,發酵第5天時細菌菌群多樣性最高。劉蕓雅等[4]研究發現,黃酒發酵過程中的微生物組成與酒曲有一定的相關性,在屬水平上黃酒發酵液中主要優勢細菌包括糖多孢菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、高溫放線菌屬、乳桿菌屬等,不同的細菌變化情況呈現多樣性,并與發酵條件存在對應關系。

微生物菌群結構對黃酒風味物質的生成具有重要影響。Mou等[9]采用宏基因組學分析了黃酒發酵過程中真菌與風味物質之間的關系,結果表明揮發性風味物質的生成受發酵液性質及微生物多樣性的影響很大。Liu等[10]的研究表明,在黃酒發酵過程中,細菌中 10 個主導屬具有不同的變化特性,其中芽孢桿菌和乳酸菌是最主要的細菌屬,并且形成黃酒中重要的風味化合物[11]。劉蕓雅[12]研究表明黃酒發酵過程中芽孢桿菌屬與 3種酯類、1 種吡嗪類物質的相關性較強;而乳桿菌屬、明串珠菌屬和腸桿菌屬與有機酸有良好的相關性;假單胞菌屬、腸桿菌屬分別與 13 種、8 種揮發性成分有較強的相關性。

本文通過研究玉米黃酒發酵過程中微生物菌群結構和揮發性風味物質的變化,利用多元統計方法分析菌群結構與風味物質的相關性,為解釋玉米黃酒發酵過程中風味物質的生成特點和篩選優良菌株提供了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 玉米黃酒發酵工藝

稱取一定量洗干凈的脫胚玉米(產自黑龍江省齊齊哈爾市)置于0.15%～0.2%的亞硫酸溶液中,55 ℃水浴下浸泡48 h。之后將玉米用清水進行沖洗,瀝干后備用。將浸過的脫胚玉米放入蒸鍋中,蒸米45 min。將蒸熟的脫胚玉米緩慢降溫至35 ℃左右,放入 2 000 mL燒杯中,加入酒曲(0.1%～0.2%,購于廣西省),攪拌均勻,用4層紗布封口,置于恒溫培養箱(SPX-150Ⅱ,天津市泰斯特儀器有限公司)中,于30 ℃下培養3 d,然后在燒杯內加入玉米質量2倍的水,于25 ℃下發酵30 d。

1.2 16S rDNA/ITS高通量測序

1.2.1 基因組提取

在玉米黃酒發酵第0,6,12,18,24,30天取樣,每次取10 mL樣品于無菌離心管中,在高速離心機(HERMLE-Z200A,賀默(上海)儀器科技有限公司)中以4 000 r/min離心10 min,上清液用于揮發性風味成分分析,沉淀用于提取基因組高通量分析。

1.2.2 微生物菌群結構檢測

對黃酒進行宏基因組提取后,使用帶Barcode的引物341F-806R和ITS1F-ITS2R擴增16S V4和ITS不同基因區域[13-14]。PCR擴增條件:步驟一:95 ℃進行5 min;步驟二:95 ℃進行30 s;步驟三:55 ℃進行30 s;步驟四:72 ℃進行45 s;步驟二～步驟四進行27次循環;步驟五:72 ℃進行10 min。PCR擴增體系見表1。

表1 PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system

將同一樣品的PCR產物進行混合,使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,PCR產物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)進行凝膠切割回收,純化好的 DNA 樣品于-20 ℃ 保存。將PCR擴增后的產物送交上海美吉公司利用Illumina MiSeq PE300測序平臺進行高通量測序。將測定的結果進行優化序列統計,并根據序列相似度水平為97%生成OTU。OTU產生后,統計樣品中含有的OTU情況及每個OTU中含有序列的數目,將序列與Silva庫對比,得到序列的分類學信息。在此基礎上進行樣品菌群的豐度指數(Chao 1)、多樣性指數(Shannon/Simpson)及覆蓋率指數(Coverage)分析。多樣性指數分析利用Mothur軟件實現[15]。相關性分析利用Simca-P 14.1和SPSS軟件實現[16]。根據屬分類繪制每種玉米黃酒樣品的菌群結構柱狀圖。

1.3 揮發性風味物質測定

1.3.1 樣品處理

揮發性風味物質利用三重串聯四極桿氣質聯用儀(7890B,Agilent Technologies Inc.,USA)。樣品處理根據參考文獻[17],取0.75 mL樣液于10 mL頂空瓶中,加入1 g NaCl、2.25 mL蒸餾水,加蓋密封,混合均勻后放入70 ℃水浴鍋中平衡40 min,用氣密針吸取1 mL瓶內液上氣體注入氣質色譜儀中進行定性和定量分析,得出樣液中揮發性風味物質的含量。

1.3.2 GC/MS分析條件

色譜條件:Agilent HP-5MS色譜柱(30×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫:初始溫度50 ℃,保持2 min,然后以5 ℃/min的速率升到100 ℃,再以10 ℃/min的速度升至240 ℃,保持5 min。進樣口溫度250 ℃;柱流速1 mL/min;載氣He(純度大于99.999%);不分流進樣;進樣量1 mL。

質譜條件:電子能量70 eV;離子源溫度220 ℃;質量掃描范圍35～450 amu;溶劑延遲時間4 min。

1.3.3 定量分析方法

通過質譜庫進行定性分析,用峰面積歸一化法進行計算,從而得到待測組分百分比含量,公式如下:

式中:Mi為樣品中檢測組分百分比含量,Ai為檢測組分峰面積,A1+A2+A3+…+An為樣品中所有檢測到組分峰面積之和。

2 結果與討論

2.1 玉米黃酒發酵過程中微生物菌群結構分析

2.1.1 玉米黃酒發酵過程中細菌菌群分析

在玉米黃酒發酵過程中,分別在第0,6,12,18,24,30天取酒樣,進行菌群結構和多樣性分析。細菌OTU統計結果及多樣性指數見表2。

表2 細菌OTU聚類統計及多樣性指數表Table 2 Clustering statistics and diversity indexes of bacterial OTU

由表2可知,隨著發酵時間的延長,OTU數呈先減少后增多再減少的趨勢。發酵第0天時,OTU數最大,說明在發酵初期,細菌的種類組成最豐富。Chao 1在生態學中用來估算樣品中物種總數[18]。反映環境體系中微生物多樣性多采用Shannon指數和Simpson指數,Simpson指數越大,說明體系中微生物多樣性越低,而Shannon指數則正好相反。Chao 1值先減少后增多再減少,Shannon值變化也是如此,說明這一階段的物種總數變化和多樣性也呈此規律,隨著時間的延長,在高酸和高乙醇濃度的抑制下,微生物多樣性逐漸降低。而Simpson指數的變化也印證了這一規律,第0天指數值為0.06,到第12天則為0.123,第18天降為0.093,第30天升到0.118,測序深度反映了測序的覆蓋范圍,結果均大于0.999,說明測序深度足夠,結果可靠。

利用高通量測序技術,在玉米黃酒發酵過程中共檢測到239個細菌屬。其中有18個主要細菌屬(以下括號內數字為該屬的平均豐度),分別為魏斯氏菌屬(Weissella,21.28%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium,16.80%)、嗜氫菌屬(Hydrobacter,10.09%)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora,4.90%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,4.26%)、Chloroplast_norank菌屬(3.96%)、乳球菌屬(Lactococcus,3.63%)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter,3.40%)、Ralstonia菌屬(2.76%)、不動桿菌屬(Acinetobacter,1.79%)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas,1.53%)、諾卡氏菌屬(Nocardia,1.48%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,1.43%)、Reyranella菌屬(1.43%)、貪銅菌屬(Cupriavidus,1.32%)、Pseudolabrys菌屬(1.11%)、鞘氨醇單胞菌屬(Novosphingobium,0.86%)、Muribaculaceae_norank菌屬(0.5%)。其余菌屬總平均豐度小于0.5%。在屬水平上繪制玉米黃酒中細菌菌群結構柱狀圖,見圖1。

圖1 玉米黃酒發酵過程中細菌屬水平相對豐度變化Fig.1 Changes of the relative abundance of bacterial genera during the fermentation of corn yellow wine

由圖1可知,在玉米黃酒發酵過程中,不同的細菌屬呈現出不同且復雜的變化特點。其中慢生根瘤菌屬、嗜氫菌屬、乳桿菌屬、糖多孢菌屬呈先升高后下降再升高的趨勢,另外乳桿菌屬、糖多孢菌屬的占比在發酵末期達到峰值8.46%和6.25%。說明這些菌群在發酵初期比較適應發酵體系,到了中期由于酸度和乙醇濃度的提高,一部分不耐酸和乙醇的菌群消亡,另一部分則適應了這種環境繼續繁殖。而貪銅菌屬、嗜鹽單胞菌屬、乳球菌屬、檸檬酸桿菌屬、魏斯氏菌屬、Reyranella菌屬都隨發酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢,并且都在發酵中期出現相對豐度最大值,分別為2.75%、3.47%、4.41%、4.31%、27.33%、1.54%。這些細菌的生長繁殖大都需要氧氣的參與,因此在發酵前期氧氣較豐富的情況下,菌屬占比快速升高,而到了發酵中期,氧氣被消耗形成低氧環境,抑制了占比擴大的趨勢。不動桿菌先下降后上升,說明這種菌屬有著較強的環境適應能力。Chloroplast_norank菌屬、假單胞菌屬、Muribaculaceae_norank菌屬、鞘氨醇單胞菌屬從發酵初期就呈下降趨勢,直到末期。諾卡氏菌屬、Pseudolabrys菌屬、Ralstonia菌屬的豐度在發酵過程中一直保持穩定。

2.1.2 玉米黃酒發酵過程中真菌菌群結構變化分析

真菌OTU統計結果及多樣性指數見表3。

表3 真菌OTU聚類統計及多樣性指數表Table 3 Clustering statistics and diversity indexes of fungal OTU

由表3可知,真菌測序深度(覆蓋率)均達到0.999以上,說明檢測全面。真菌的OTU數呈現出先增加后減少的變化特點,并在第18天達到峰值,為35。真菌的OTU數變化與細菌差別很大,而且遠遠低于細菌的OTU數,在發酵末期真菌OTU數不到細菌種類的1/4,這和傳統發酵食品泡菜的微生物群落變化十分相似[19]。隨著發酵時間的延長,Shannon指數呈先升高后降低的趨勢,Simpson指數則先降低再升高,說明這一階段真菌的物種總類和多樣性也是這樣變化的,但與細菌多樣性變化不同的是,發酵末期與發酵初期相比物種總類和豐度有所增加。

在玉米黃酒發酵過程中共檢測出19個真菌屬,包括1種未分類菌屬。其中曲霉菌屬(Aspergillus,56.76%)、Cyberlindnera菌屬(40.26%)、Kwoniella菌屬(1.23%)、異常威克漢姆酵母菌屬(Wickerhamomyces,1.17%)、紅酵母菌屬(Rhodotorula,0.32%)、根霉菌屬(Rhizopus,0.11%)、毛霉菌屬(Mucor,0.07%)、Meyerozyma菌屬(0.04%)和出芽短梗霉菌屬(Aureobasidium,0.02%)是玉米黃酒發酵過程中的9種主要菌屬(括號內數字為該屬的平均豐度),其余菌屬平均豐度小于0.01%。在屬水平上繪制真菌菌群結構柱狀圖,見圖2。

圖2 玉米黃酒發酵過程中真菌屬水平相對豐度變化Fig.2 Changes of relative abundance of fungi during the fermentation of corn yellow wine

由圖2可知,曲霉菌屬和Cyberlindnera菌屬是玉米黃酒發酵醪液中的絕對優勢菌屬,對玉米黃酒芳香物質的生成起到重要作用。這兩種菌屬呈現出不同的變化特點,從發酵第0天～第6天,曲霉菌屬相對豐度明顯下降,而Cyberlindnera菌屬的相對豐度顯著升高。從第6天～第24天,兩種菌屬的相對豐度都比較穩定,從第24天～第30天,曲霉菌屬的相對豐度明顯下降,而Cyberlindnera菌屬的相對豐度又顯著增加,達到最大值。在發酵前期,在玉米黃酒發酵液中含有豐富的氧氣,大量的曲霉菌屬產生水解酶,分解原料的大分子物質,如將淀粉水解為還原糖,為酒精發酵提供碳源和能源。隨著發酵的進行,氧氣逐漸被消耗,乙醇濃度越來越高,因此曲霉屬的相對豐度逐漸降低。而Cyberlindnera菌屬是主要產酒精的微生物,它能夠適應高酸和高乙醇的環境,在曲霉菌屬逐漸減少的情況下,Cyberlindnera菌屬為發酵后期的主要菌屬。在發酵末期相對豐度升高的微生物還有Kwoniella菌屬、Meyerozyma菌屬、毛霉菌屬和紅酵母菌屬,說明這些微生物能夠耐受高酸、高乙醇環境。而出芽短梗霉菌屬、根霉菌屬、異常威克漢姆酵母菌屬的相對豐度有所下降,說明這些微生物對高酸和高乙醇環境不耐受。

2.2 玉米黃酒發酵過程中揮發性風味物質含量的變化

玉米黃酒在發酵過程中會由于菌群的代謝形成大量的揮發性風味物質,主要是酯類和醇類物質,它們對黃酒酒體風格特征起到了重要影響。利用GC-MS技術對不同發酵時期的玉米黃酒進行檢測,檢測到24種揮發性風味物質,包括14種酯類物質、5種醇類物質以及其他類化合物,結果見表4。

表4 玉米黃酒釀造過程中揮發性風味物質的含量變化Table 4 Changes of the content of volatile flavor substances during the fermentation of corn yellow wine

酯類物質是玉米黃酒中第一大類揮發性風味物質,乙醇酯是主要的酯類物質,因為乙醇是酒中含量最高的醇類物質,它能與各種酸類物質進行酯化反應,生成大量乙醇酯[20]。由表4可知,在玉米黃酒發酵過程中,酯類物質含量呈現出比較復雜的變化特性。有一些酯類物質含量在整個發酵期間比較穩定,如己酸乙酯、乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、琥珀酸二乙酯、丙位壬內酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯。而丁酸異戊酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸苯乙酯的含量呈逐漸升高的趨勢。乙酸辛酯和亞油酸乙酯的含量下降很多。

高級醇類物質是玉米黃酒中第二大類揮發性風味物質。在本次實驗中,從玉米黃酒中共檢測到5種醇類物質,其中異戊醇是含量最多的醇類物質,其次為苯乙醇和異丁醇,庚醇和異丙醇含量較少。玉米黃酒發酵過程中,醇類物質整體呈先升高后保持平穩,然后稍有下降的趨勢。大部分高級醇類物質在發酵12 d前達到了峰值,其主要原因是高級醇主要由酵母通過代謝作用生成,在發酵前期,還原糖含量較高,酵母生成乙醇和其他高級醇的速度較快,而到了中期以后,還原糖含量減少,生成的高級醇的數量變少,到了發酵后期,部分高級醇被酯化,導致其含量稍有下降。

在玉米黃酒中還檢測到了3種醛酮類、1種烯類、1種酸類等揮發性風味物質。其中香葉基丙酮、癸醛、苯甲醛、苯乙烯等揮發性物質都在發酵開始時含量最高,之后含量逐漸下降。而2-氨基-6-甲基苯甲酸在發酵18 d時含量達到最高,之后含量下降。

2.3 微生物與揮發性風味物質的相關性分析

利用Simca軟件對27個主要微生物屬和揮發性物質進行相關重要性分析。橫坐標為微生物屬,縱坐標VIP(pred)為微生物屬與揮發性風味物質的重要性指標。與揮發性組分相關的重要微生物屬分析見圖3。

由圖3可知,27種主要微生物屬與揮發性風味物質之間的VIP(pred)值都在0.35～1.25之間,其中VIP(pred)值>1.2的有2個屬,VIP(pred)值在1.1～1.2之間的有10個屬,VIP(pred)值在1.0～1.1之間的有4個屬,選取VIP(pred)值>1的16個微生物屬與揮發性組分進行相關性分析,見表5。

表5 微生物與揮發性組分相關性分析結果Table 5 Correlation analysis results of microorganisms and volatile components

相關性分析結果顯示,有14種揮發性物質與一種或多種微生物屬具有顯著相關性。 其中Weissella屬、Lactobacillus屬、Pseudomonas屬、Rhodotorula屬、Kwoniella屬等均與多種酯類物質的生成具有顯著相關性。Weissella屬是發酵食品領域常見的菌屬,它既可以代謝產生有機酸,還可以產生大量的酯類物質,在泡菜以及白酒發酵過程中都有發現[21]。在玉米黃酒發酵過程中,Weissella屬與異丁醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯的生成具有顯著相關性。Lactobacillus屬是很多酒中的優勢菌群,與乳酸和乳酸乙酯的生成息息相關,也是白酒中的主要菌群之一,它在玉米黃酒發酵過程中與丁酸異戊酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸苯乙酯代謝生成具有明顯的相關性。Pseudomonas屬是一種條件致病菌,但它在很多白酒發酵中又是優勢菌群[22],在玉米黃酒中發現它與亞油酸乙酯、苯甲醛和苯乙烯有明顯相關性。Rhodotorula屬是葡萄酒中的重要組成微生物,有增香和降解氨基甲酸乙酯的作用,在乳制品和泡菜中也經常出現[23],是玉米黃酒中的主要菌屬之一,它與癸酸乙酯、乙酸苯乙酯等幾種酯類物質的生成具有顯著相關性。Kwoniella屬被發現存在于茅臺鎮白酒主釀區域中,但是對于生香成分目前研究甚少[24],在玉米黃酒中與丁酸異戊酯、庚醇具有顯著相關性。

3 結論

玉米黃酒發酵過程中,微生物菌群結構復雜,并且隨著發酵的進行,微生物菌群結構也發生著變化,不同微生物的相對豐度在發酵期間呈現出不同的變化。在玉米黃酒發酵過程中共鑒定出239個細菌屬,其中有18個為主要細菌屬,鑒定出18個真菌屬,其中Aspergillus和Cyberlindnera等9個屬是主要真菌屬。在玉米黃酒發酵過程中共檢測出24種揮發性風味物質,包括14種酯類物質、5種醇類物質以及其他類化合物,它們在整個發酵過程中呈現出不同的變化規律。相關性分析結果表明,有16種微生物屬與14種揮發性風味物質具很高的相關性,其中Weissella、Lactobacillus、Pseudomonas、Rhodotorula、Kwoniella與乙酯類化合物及高級醇有顯著相關性。由此說明玉米黃酒發酵過程中風味物質的生成是多種微生物共同作用的結果。