L-酪氨酸清液發酵工藝研究

時唐恩,趙思宇,劉韙瑋,趙春光,徐慶陽*

(1.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;2.寧夏伊品生物科技股份有限公司,銀川 750100)

L-酪氨酸在生產生活中應用廣泛。L-酪氨酸與無機碘化物在甲狀腺處生成甲狀腺激素[1-3];L-酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下轉化成多巴色素,多巴色素再經過一系列生化反應變成黑色素[4-6];去腎上腺素、腎上腺素、多巴胺都是以L-酪氨酸為前體物質生成的[7]。L-酪氨酸還作為食品和飼料添加劑被廣泛應用[8-11]。

傳統發酵法生產L-酪氨酸的過程中,容易造成發酵液黏稠渾濁、泡沫豐富、色素問題嚴重,從而導致發酵生產L-酪氨酸產率低,不利于后期L-酪氨酸的分離提取,所以有必要開發一種新型清液發酵來近似替代玉米漿、豆粕水解液發酵生產L-酪氨酸[12]。

在滿足菌體生長繁殖的基本條件下,探究添加物質最佳用量,并根據菌株生產特性選取了天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸等營養添加物質。其中天冬氨酸作為泛酸的合成前體物質之一,后者可在體內轉變成CoA或ACP參與脂肪酸代謝反應;在一定范圍內增加琥珀酸的添加量會提高谷氨酸產量[13];谷氨酸可提供一分子氨基,將對羥基苯丙酮酸轉化為酪氨酸,自身轉化為一分子α-酮戊二酸,參與檸檬酸循環;芳香族氨基酸的合成途徑中[14],苯酸作為苯丙氨酸和酪氨酸的共同前體物質,添加苯丙氨酸促使反應向酪氨酸途徑進行;色氨酸也屬于芳香族氨基酸,分支酸作為芳香族氨基酸的生物合成系統中的中間體,添加色氨酸會反饋抑制色氨酸合成途徑,從而加強酪氨酸的合成方向;鳥苷、腺苷、肌苷等核苷類物質能夠參與機體內的能量代謝反應[15];生物素是多種羧化酶的輔酶,同時生物素參與控制細胞膜的合成[16-18]。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-酪氨酸生產菌E.coliTR03:由天津科技大學代謝工程實驗室保存。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 3 g/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 清液發酵培養基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 2 g/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,天冬氨酸2 g/L,谷氨酸2.3 g/L,琥珀酸1.5 g/L,色氨酸1.5 g/L,苯丙氨酸1.5 g/L, FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,生物素2 mg/L,鳥苷0.3 g/L,腺苷0.3 g/L,肌苷0.4 g/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.3 對照發酵培養基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 2 g/L,蛋白胨 5 g/L,豆粕水解液10 mL/L, 玉米漿4 mL/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.3 實驗器材

儀器設備見表1。

表1 儀器設備Table 1 Instruments and equipment

1.4 檢測方法

1.4.1 殘糖檢測

取發酵液于1.5 mL EP管中,15 000 r/min離心2 min,將上清液用去離子水稀釋10倍,取稀釋后的上清液25 μL快速注入SBA-40E生物傳感分析儀中檢測。

1.4.2 OD600 nm檢測

用1.5 mL EP管收集發酵液,將其稀釋100倍后用722分光光度計進行檢測,所得數值乘以100即為發酵液的OD600 nm數值。

1.4.3 L-酪氨酸的檢測

將發酵液進行適當倍數的稀釋以使L-酪氨酸晶體全部溶解,13 000 r/min離心2 min,再用去離子水將上清液稀釋至一定倍數,經0.22 μm微孔過濾后采用高效液相色譜法[19]檢測發酵液中的L-酪氨酸含量。采用 Kromasil C18色譜柱(250 mm×460 mm,5 μm),流動相為10%乙腈溶液,柱溫設定為40 ℃,流速為1 mL/min,保留時間為10 min,檢測波長為230 nm,進樣量為20 μL。

1.4.4 糖酸轉化率計算

式中:ρ為L-酪氨酸質量濃度,g/L;V為發酵液總體積,L;m為總耗糖量,g。

1.5 單因素實驗優化

通過搖瓶的方式,將自變量設置5組濃度梯度,進行單因素實驗優化,單因素實驗表見表2。

表2 單因素實驗表Table 2 Single factor experiment table

1.6 正交實驗優化

由于天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和生物素對實驗結果的影響較大,在單因素實驗的基礎上,將天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和生物素通過設置四因素三水平的正交實驗L9(34)方式使用搖瓶進行進一步優化,正交實驗因素水平見表3。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.7 5 L發酵罐驗證

5 L發酵罐進一步驗證清液培養基與傳統培養基發酵過程中的各種參數(L-酪氨酸產量、OD600 nm、上清透光率),5 L發酵罐的控制條件:溫度 37 ℃;pH 7.0;溶氧20%～30%;根據溶氧變化控制轉速200～800 r/min;每隔2 h測定菌體OD600 nm和L-酪氨酸產量。

1.8 分離提取

分別將對照實驗組傳統發酵液與清液發酵液分離提取,首先用鹽酸調節兩種發酵液的pH至0.5,加入活性炭吸附除雜,然后利用50 nm陶瓷膜進行菌體過濾;過濾液冷卻至10 ℃,加氨水調節pH至5.7,進行等電點結晶,離心或過濾收集L-酪氨酸濕晶體,80 ℃干燥即得L-酪氨酸晶體產品。

2 結果與討論

2.1 單因素對結果的影響

2.1.1 單因素對L-酪氨酸產量的影響

在搖瓶中控制一種添加物含量變化,觀察單一因素變化對L-酪氨酸產量的影響,見圖1。

圖1 搖瓶中不同添加物含量對L-酪氨酸產量的影響Fig.1 Effect of different additives' content in shaker on the yield of L-tyrosine

由圖1可知,生物素添加量從1.0 mg/L增加到2.0 mg/L時,L-酪氨酸的產量逐步增加,在2.0 mg/L附近L-酪氨酸產量達到最大值。從2.0 mg/L繼續增加生物素添加量時,L-酪氨酸的產量與生物素的添加量成反比關系,此時L-酪氨酸的合成受到抑制,由此可以確定生物素的最佳添加量為2.0 mg/L。控制苯丙氨酸的含量變化時,苯丙氨酸從1.0 g/L增加到1.5 g/L時,L-酪氨酸的產量逐步提高,在添加量為1.5 g/L時L-酪氨酸的產量達到最大值,并且在繼續加大苯丙氨酸添加量的過程中,L-酪氨酸的產量逐步趨于穩定,過量的苯丙氨酸并不會增加產物的生成,從節約資源和產物生成量的角度,確定苯丙氨酸的最佳添加量為1.5 g/L。根據相同的分析方法可以得出,天冬氨酸的最佳添加量為2.0 g/L左右時,L-酪氨酸的產量達到最高峰;谷氨酸的最佳添加量為2.5 g/L左右時,L-酪氨酸的產量達到最高峰;琥珀酸和色氨酸的最佳添加量都為1.5 g/L左右時,L-酪氨酸的產量達到最高峰;肌苷的最佳添加量為0.4 g/L左右時,L-酪氨酸的產量達到最高峰;鳥苷和腺苷的最佳添加量為0.3 g/L左右時,L-酪氨酸的產量達到最高峰。

2.1.2 單因素對清液發酵生物量的影響

控制一種添加物含量變化,觀察單一因素變化對清液發酵生物量的影響,見圖2。

圖2 不同添加物含量對生物量的影響Fig.2 Effect of different additives' content on biomass

由圖2可知,在空白對照實驗組中,天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、生物素對大腸桿菌生物量的影響較大。在分別不添加天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、生物素時,大腸桿菌的OD600 nm值比不添加其他物質的低,表明這4種物質對E.coliTR03菌種生長的影響比較大。苯丙氨酸添加量從1.0～1.5 g/L時,菌體生物量逐步增加,在添加量為1.5 g/L時OD600 nm達到最大值,之后隨著苯丙氨酸添加量的逐漸增加,菌體生物量逐漸穩定,說明當添加物含量增加到一定值時,該物質不再是限制E.coliTR03菌種產酸的主要因素。由此可以確定苯丙氨酸添加量為1.5 g/L時對菌體的生長最有利,為最佳添加量。根據相同的分析方法,可以確定天冬氨酸 2.0 g/L、谷氨酸2.2 g/L、琥珀酸1.6 g/L、色氨酸1.5 g/L、鳥苷0.3 g/L、腺苷0.3 g/L、肌苷 0.4 g/L最有利于E.coliTR03菌種的生長,使其達到最大的OD600 nm值。生物素添加量為2.0 mg/L時OD600 nm達到最大值,之后隨著添加量的不斷增大,大腸桿菌的OD600 nm值急劇升高,當添加量為5.0 mg/L時,大腸桿菌的OD600 nm值超過100。結合圖1可知,大腸桿菌的OD600 nm值升高到一定范圍后,L-酪氨酸的產量反而下降。生物素通過控制細胞膜的生成量而影響大腸桿菌的OD600 nm值。

2.2 正交實驗優化培養基

圖1分析了單一因素對L-酪氨酸產量的影響,在單因素實驗的基礎上,挑選了生物素、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸4種對L-酪氨酸產量影響較大的物質,通過正交實驗的方法以L-酪氨酸產量作為參考指標,根據表3設計正交實驗,通過搖瓶的方式進一步優化培養基配比,見表4。

表4 L-酪氨酸產量正交實驗結果Table 4 Results of L-tyrosine yield orthogonal experiment

2.3 5 L發酵罐進一步驗證結果

2.3.1 清液發酵與傳統發酵對L-酪氨酸產量的影響

發酵過程中,清液發酵與傳統發酵L-酪氨酸生產菌E.coliTR03生產L-酪氨酸的能力對比見圖3。

圖3 清液發酵與傳統發酵L-酪氨酸產量、OD600 nm對比Fig.3 Comparison of L-tyrosine yield and OD600 nm between clear liquid fermentation and traditional fermentation

由圖3可知,發酵前期清液發酵與傳統發酵L-酪氨酸產量基本相同,在6 h時,清液發酵液產酸提前進入對數期,L-酪氨酸的生成速度加快,而傳統培養基菌液產酸在8 h時進入對數期。在對數期,清液發酵液比傳統發酵液生產L-酪氨酸的速度快,且傳統發酵液產酸比清液發酵液產酸提前進入穩定期。傳統發酵在32 h時L-酪氨酸基本不再生成,最終產量在45.0 g/L左右。而清液發酵液在36 h時產量為55.2 g/L,清液發酵產酸能力比傳統發酵產酸能力提高了22.7%,說明清液發酵液的營養成分更適合L-酪氨酸生產菌E.coliTR03的發酵產酸。

2.3.2 清液發酵與傳統發酵對生物量的影響

由圖3可知發酵過程中清液發酵與傳統發酵L-酪氨酸生產菌E.coliTR03在36 h內生物量變化的對比情況,清液發酵液與傳統發酵液都從2 h開始進入對數生長期,清液發酵液的OD600 nm比傳統發酵液的OD600 nm增長迅速,清液發酵比傳統發酵提前進入穩定期,分別為10 h和12 h。清液發酵液的OD600 nm最大值為98,傳統發酵液的OD600 nm最大值為83,改良后的清液發酵相對于傳統發酵生物量提高了18.1%。傳統發酵32 h時生物量開始急劇下降,說明此時傳統發酵進入了衰亡期,而清液發酵一直到36 h時仍然處在穩定期,表明清液發酵可以使發酵液提前進入穩定期且可以將穩定期維持更長的時間,有利于L-酪氨酸的生產。

2.3.3 清液發酵與傳統發酵對上清液透光率和糖酸轉化率的影響

傳統發酵和清液發酵上清液透光率與糖酸轉化率對比見表5。

表5 傳統發酵和清液發酵上清透光率與糖酸轉化率對比Table 5 Comparison of supernatant light transmission rate and sugar-acid conversion rate between traditional fermentation and clear liquid fermentation

由表5可知,發酵35 h后取上清液測量,傳統培養基的上清液透光率只有26.9%,而清液培養基的上清液透光率為47.8%,上清液透光率提高了20.9%,表明將發酵液中色素含量高的玉米漿、豆粕水解液和蛋白胨利用各種色素含量低的氨基酸、核苷類等物質等效替換后,發酵液中的色素泡沫雜質類物質明顯降低,使上清液透光率明顯升高,符合清潔綠色環保的標準。傳統發酵和清液發酵的糖酸轉化率分別為20.6%、25.2%,相比提高了4.6%,提升效果明顯。

2.4 清液發酵與傳統發酵對分離提取的影響

傳統發酵與清液發酵在0.8%活性炭添加量、pH 0.5、設定溫度80 ℃、時間30 min的條件下,分離提取L-酪氨酸過程中的各項參數,見表6。

表6 傳統發酵與清液發酵分離提取各項參數Table 6 Parameters of separation and extraction of traditional fermentation and clear liquid fermentation

由表6可知,傳統發酵液與清液發酵液的蛋白去除率分別為76.5%、72.1%,清液發酵液的蛋白去除率比傳統發酵蛋白去除率低,原因是經過培養基的優化,清液發酵液中的生物量有所提高,從而導致在相同時間內生物量高的發酵液蛋白去除率偏低。經過L-酪氨酸產物提取,清液發酵L-酪氨酸提取率為92.6%,傳統發酵L-酪氨酸提取率為80.9%,清液發酵提取率提高11.7%,因此證明清液發酵通過降低發酵液的黏稠度、雜質和色素類物質,將分離提取的效率提高,有利于L-酪氨酸產量的提升。

3 結論

本實驗通過等效替代的方法優化了傳統培養基的成分,利用部分氨基酸、核苷和生物素替換傳統培養基中的蛋白胨、豆粕水解液和玉米漿,從而解決了發酵液濃稠、色素雜質多、泡沫多等問題導致的L-酪氨酸產量低、分離提取率低、難度大等現象。通過單因素實驗方法確定了添加物最優添加范圍,在單因素實驗的基礎上進一步優化了生物素、谷氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸添加量,最終確定所有添加物最佳添加量為天冬氨酸 2.2 g/L、谷氨酸2.4 g/L、苯丙氨酸 1.5 g/L、色氨酸1.5 g/L、琥珀酸1.5 g/L、生物素 1.0 mg/L、鳥苷 0.3 g/L、腺苷 0.3 g/L、肌苷 0.4 g/L。通過5 L發酵罐進一步驗證得出,優化后的培養基在各方面的發酵性能都有所提升。5 L發酵罐發酵35 h,清液發酵的OD600 nm為98,比傳統發酵的 OD600 nm提高18.1%;清液發酵的生物量比傳統發酵的生物量高,導致在條件相同的情況下,清液發酵比傳統發酵的蛋白去除率低,但是清液發酵的L-酪氨酸產量為55.2 g/L,比傳統培養基發酵提高22.7%;上清液透光率為47.8%,比傳統培養基提高20.9%。最后通過分離提取驗證,清液發酵L-酪氨酸分離提取率為92.6%,比傳統發酵的提取率提高11.7%。由此證明該清液培養基無論是在清潔環保方面還是在發酵性能和分離提取方面都表現出不錯的效果。