ATP敏感性鉀通道亞基突變對血管生理特性的影響*

宋 濤 黃 燕

Cantu綜合征(MIM 239850)是一種新型ATP敏感性鉀離子通道病[1,2],病變累及全身多個系統和器官[3];患者主要表現為多毛征、面容粗糙、骨骼異常、精神智力發育遲緩、心血管缺陷等,約80%的患者合并有心血管缺陷,包括心臟增大、血管擴張、血壓降低、動脈導管未閉、心律失常、肺動脈高壓[4]。Cantu綜合征臨床危害大,嚴重影響患者生活質量:24%的患者有肺動脈高壓,新生患兒因肺動脈高壓需要長期呼吸機輔助呼吸[5],18%的患者合并有心律失常,14%的患者有心衰病史[4],這些心血管異常甚至在新生嬰兒期即可發生,但目前尚無有效治療方法,且Cantu綜合征患者心血管異常的病理機制亦不清楚[4,5]。

目前發現的Cantu綜合征患者均存在編碼KATP通道亞單位的基因突變[6-10]即ABCC9或KCNJ8突變,已檢測出來的突變位點至少有30個[4],重組細胞實驗表明這些突變均為功能獲得性突變[6]。本課題組前期制備了帶有Cantu綜合征患者突變基因(Kir6.1[V65M])的小鼠,本研究主要探討該突變對小鼠血壓、血管張力、平滑肌細胞鈣電流等動脈血管生理特性的影響,以期為Cantu綜合征的發病機制及臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

將8-10周齡Kir6.1wt/VM(V65M+/-)進行相互交配,繁殖得同窩野生型小鼠Kir6.1wt/wt(V65M+/-)、雜合子Kir6.1wt/VM(V65M+/-)、純合子Kir6.1VM/VM。由于純合子小鼠出生后三周左右均死亡,且臨床上Cantu患者均為雜合子突變,故本實驗納入8-10周齡同窩野生型小鼠Kir6.1wt/wt(野生組,n=35)和雜合子Kir6.1wt/VM(突變組,n=52)作為實驗對象,雌雄不限。小鼠飼養于SPF 級動物房,自由進食進水,飼料經鈷 60 照射滅菌,水高壓處理,動物房內溫度恒定于22-24℃,濕度為 50-60%,燈光控制12h明暗交替。本實驗經武漢大學人民醫院倫理委員會批準,符合《實驗動物飼養管理和使用指南》。

1.2 主要儀器和設備

壓力傳感器(Model SPR-671,澳大利亞),PowerLab數據采集系統(AD Instruments,澳大利亞),LabChart 7 數據分析軟件(AD Instruments,澳大利亞),倒置顯微鏡(Olympus,日本),張力傳感器(Panlab,西班牙),成都泰盟生物電子儀器公司生產的新型420生物機能試驗操作系統,膜片鉗HEKA系統(HEKA,德國)。

1.3 主要試劑及藥品

1.5%異氟烷購自深圳瑞沃德科技有限公司(批號:R510-22-10),去甲腎上腺素(批號:U1468501),吡那地爾(批號:TMLT12478),NaCl(批號:10019308),KCl(批號:10016308),MgSO4-7H2O (批號:10013018),KH2PO4(批號:100176008),NaHCO3(批號:10018960),EDTA(批號:53219860),葡萄糖(批號:FBP350101)等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。Krebs-Ringer溶液(mmol/L):NaCl 120.00,KCl 5.90,CaCl22.50,MgSO41.20,NaH2PO41.20,NaHCO315.50,葡萄糖 11.50 (pH 7.40)。平滑肌細胞分離液(mmol/L):NaCl 145.00,KCl 5.90,HEPES 10.00,葡萄糖 10.00,CaCl20.05,MgCl21.00。平滑肌細胞分離液1:20ml平滑肌細胞分離液+0.1%牛血清白蛋白;平滑肌細胞分離液2:2ml平滑肌細胞分離液1+3mg木瓜蛋白酶+2mg二硫赤蘚糖醇;平滑肌細胞分離液3:2ml平滑肌細胞分離液1+3mg膠原酶+2mg胰蛋白酶抑制劑+1mg彈性蛋白酶。記錄鈣電流的細胞外液(mmol/L):NaCl 137.00,CsCl 5.40,CaCl21.80,MgCl20.50,葡萄糖 10.00,HEPES 5.00,NaHCO33.00,NaH2PO40.16 (pH 7.40);記錄鈣電流的細胞內液(mmol/L):CsCl 130.00,TEA-Cl 20.00,MgCl21.00,CaCl20.50,K2ATP 3.00,EGTA 5.00,HEPES 10.00 (pH 7.40)。腎素、血管緊張素II、醛固酮ELISA試劑盒(批號分別為:DY4277,LS-F523,KA1883)。

1.4 血壓測量

小鼠吸入1.5% 異氟烷麻醉,并置于加熱墊上保持身體溫度。頸中線處切開2-3mm皮膚,分離胸腺和肌肉,露出右側頸動脈,小心地將壓力傳感器插入右頸動脈并移至升主動脈。使用PowerLab數據采集系統記錄收縮壓、舒張壓和心率,并使用LabChart 7對數據進行分析。

1.5 動脈環制備及血管張力測量

異氟烷麻醉小鼠安樂死后,摘取其降主動脈,分離、清除附著結締組織,制成3mm長的動脈環,將動脈環穿過兩個邊長為2cm的等邊三角形不銹鋼小鉤后,置于盛有20ml Krebs-Ringer液的恒溫(37℃,95%O2+5%CO2平衡)離體血管灌注浴槽內,下端固定于槽底部,上端通過張力換能器與Power lab八道生理記錄儀相連,記錄動脈環張力變化。穩定30min后,采用KCl刺激動脈環有反應后開始實驗。用60mmol/L KCl收縮血管,達到平臺期后,反復洗去KCl,再次平衡30min,加入10-6mol/L去甲腎上腺素達最大收縮后,分別觀察加入不同濃度吡那地爾(0.1μmol/L,0.3μmol/L)時血管的收縮情況,并描記曲線收縮幅度,計算不同濃度吡那地爾刺激下的血管張力與10-6mol/L去甲腎上腺素刺激下血管的張力百分比。

1.6 平滑肌細胞分離及L型鈣電流記錄

異氟烷麻醉小鼠安樂死后,摘取其降主動脈,在冰浴的生理鹽水上分離、清除附著結締組織,剪成1-2mm血管環;將血管環轉移到2ml的平滑肌細胞分離液1中,室溫孵育10min;輕輕吸出平滑肌細胞分離液1,加入2ml常溫平滑肌細胞分離液2,在37℃水浴25min,每10min輕輕顛倒數次;再轉移到平滑肌細胞分離液3中,37℃水浴5min;室溫下靜置2-3min后冰上靜置3-5min。緩慢輕輕吸走平滑肌細胞分離液3,再用0.5ml平滑肌細胞分離液1輕輕吹打數次,置于冰上,吸取75μl分離的細胞懸液置于小的載玻片上,冰塊上保存至少1h進行膜片鉗記錄。

將分離的平滑肌細胞轉移至灌流槽,用全細胞膜片鉗記錄單個平滑肌細胞的鈣電流,電極電阻2-3MΩ,記錄鈣電流程序:電位鉗制在-70mV,先給予-70mV到-45mV的梯度電壓,命令電壓從-45mV開始,65mV終止,階躍10mV,持續300ms的系列脈沖,采用Clamp及pClamp軟件完成數據的采集和分析。

1.7 小鼠血清腎素、血管緊張素II、醛固酮水平檢測

采用眼眶內眥靜脈采血,將采集的血液收集在EP管中,室溫靜置2h,4℃下3 500rpm×10min離心,收集上層血清,-80℃凍存。樣本采集完成后集中檢測,檢測前樣本室溫解凍,采用ELISA試劑盒檢測血清腎素、血管緊張素II、醛固酮水平,以此來反映RAAS系統活性。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 Kir6.1[V65M]突變對小鼠血壓的影響

與野生組小鼠比較,突變小鼠收縮壓、舒張壓降低(P<0.01),兩組小鼠心率無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠血壓、心率比較

2.2 Kir6.1[V65M]突變對小鼠血管張力的影響

與野生組小鼠比較,Kir6.1[V65M]突變組小鼠離體動脈環在60mmol/L KCl和10-6mol/L去甲腎上腺素刺激下的張力均大于野生組(P<0.05或P<0.01); 0.1μmol/L和0.3μmol/L吡那地爾使突變小鼠血管張力下降幅度大于野生小鼠(P<0.01)。見表2。

表2 兩組小鼠動脈環張力比較

2.3 Kir6.1[V65M]突變對小鼠平滑肌細胞鈣電流的影響

在預設的刺激方案刺激下,可記錄到一緩慢激活的內向電流,該電流在-45mV左右被激活,+25mV左右達電流最大值。與野生組小鼠相比,突變組小鼠鈣電流峰值明顯增加(-4.20±0.73pA/pF,n=10 vs-2.51±0.39pA/pF,n=10;t=2.214,P<0.05)。見圖1。

注:A,野生小鼠平滑肌細胞L型鈣電流原始記錄曲線圖;B,突變小鼠平滑肌細胞L型鈣電流原始記錄曲線圖;C,野生組小鼠和突變組小鼠血管平滑肌細胞L型鈣電流I-U曲線圖。*P<0.05

2.4 Kir6.1[V65M]小鼠RAAS系統被激活

與野生小鼠相比,Kir6.1[V65M]突變組小鼠血清中腎素和血管緊張素II水平升高(P<0.05)。兩組間血清醛固酮水平無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠血清腎素、血管緊張素、醛固酮水平比較

3 討 論

KATP通道廣泛分布在心肌細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞[11]。在正常生理狀態下,KATP通道通常處于關閉狀態,對細胞興奮性貢獻不大。但在嚴重的代謝壓力狀態下,如缺血缺氧,KATP通道迅速開放,在肌細胞,KATP通道開放使得動作電位時程縮短,減少鈣內流,抑制肌細胞收縮,從而減少能量消耗來保護細胞。但KATP通道開放也會帶來弊端,若KATP通道過度開放會引起心肌收縮障礙,因此KATP通道開放是一把雙刃劍[12]。KATP通道基因突變主要引起心血管系統的臨床表現,KCNJ8功能獲得性突變可引起J波綜合征、心房顫動、Cantu綜合征;KCNJ11功能獲得性突變可引起高血壓、心衰、室性心律失常;ABCC8功能缺失性突變肺動脈高壓、心房顫動;ABCC9功能獲得性突變主要引起Cantu綜合征、早復極綜合征;ABCC9功能缺失性突變引起擴張性心肌病、心房顫動[11]。

目前已明確編碼KATP通道Kir6.1和SUR2亞基的基因KCNJ8和ABCC9的常染色體顯性功能獲得性突變為Cantu綜合征的遺傳基礎[12]。除了常見多毛和面部粗糙外,Cantu綜合征患者還具有一系列心血管臨床表現,包括明顯的心臟肥大、血管擴張和扭曲、低血壓和肺動脈高壓[4]。KATP通道功能獲得性突變引起的直接結果是,KATP通道對ATP敏感性降低,KATP通道過度激活,鉀離子流增加,細胞膜超極化,鈣通道被抑制,使得血管平滑肌松弛,血管擴張,血壓降低[13],同時可導致動脈導管未閉持續存在;血管擴張可增加毛囊的氧氣、血液和營養物質供應,促進毛囊生長,導致多毛癥狀[14]。本實驗在KATP功能獲得性突變小鼠觀察到明顯的血管擴張及血壓降低,因而,KATP開放劑在臨床上也可作為治療高血壓的藥物之一。同時,在血管動脈環實驗記錄到突變小鼠在高濃度氯化鉀及去甲腎上腺素刺激下有更高的收縮反應性,這些結果表明KATP通道功能獲得性突變小鼠鈣通道活性增強或α腎上腺素能受體表達上調,高鉀溶液可誘導細胞膜電位去極化,使細胞膜電壓依賴性鈣通道激活,引起胞外鈣內流從而誘發血管收縮;去甲腎上腺素縮血管作用與促進細胞內鈣釋放和誘導細胞外鈣內流有關。這一猜想被血管平滑肌細胞L型鈣通道電流記錄進一步印證,在急性分離的突變小鼠血管平滑肌細胞記錄到顯著增加的L型鈣通道電流。

KATP通道功能獲得性突變導致血管平滑肌舒張,血管擴張血壓降低,外周血管阻力降低。但本課題組前期在Kir6.1[V65M]突變小鼠觀察到心肌肥厚以及心輸出量增加[15],本實驗在突變小鼠分離的動脈環記錄到對高濃度氯化鉀及去甲腎上腺素反應性增強。早期Ruzicka等[16]的研究表明RAAS系統激活參與了KATP通道開放劑米諾地爾誘導的心臟重構;Levin 等[17]觀察到Kir6.1轉基因小鼠交感神經活性增強;本研究在突變小鼠血清中檢測到腎素、血管緊張素II水平升高,這表明突變小鼠RAAS系統被激活,因而Cantu綜合征突變小鼠模型研究表明,KATP通道功能獲得性突變引起的原始血管擴張、血壓降低刺激頸動脈竇壓力感受器,反射性引起交感神經興奮,同時血壓降低導致腎血流量減少促進腎小球旁細胞分泌腎素,RAAS系統被激活,血管緊張素II作用于血管平滑肌,使鈣通道活性增強,同時也作用于心肌細胞,出現心肌肥厚、鈣離子通道活性增強、心肌收縮力增強,從而心輸出量增加,以此來對抗KATP通道突變引起的原始血管擴張、血壓降低;從某種意義上來說這是機體的代償調節機制。

綜上所述,KATP通道功能獲得性突變使得血管擴張、血壓降低,刺激頸動脈竇壓力感受器,反射性引起交感神經興奮,RAAS系統激活,血管平滑肌細胞鈣電流增加,使得動脈血管對收縮劑及舒張劑的反應性增加,此為機體的代償調節機制。