NGALR干擾抑制NF-κB通路阻斷腎小管細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化*

方 珣 曾星若 陳隆敏 申江曼 董 艷 呂會(huì)娟 高 思 陳文莉

高糖飲食會(huì)誘發(fā)2型糖尿病和肥胖,嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明,在喂食高糖飲食的果蠅幼蟲體內(nèi),免疫反應(yīng)途徑和先天免疫系統(tǒng)均被異常激活,大量細(xì)胞凋亡[1]。狼瘡性腎炎是一種潛在具有致命危害的自身免疫性疾病,目前的治療方法無效且通常具有較嚴(yán)重的毒副作用。自1974年世界衛(wèi)生組織引入狼瘡性腎炎組織學(xué)分類以來,對(duì)狼瘡性腎炎的關(guān)注都集中在腎小球損傷上,而臨床實(shí)驗(yàn)在近三分之一的兒童狼瘡性腎炎患者中發(fā)現(xiàn)了腎小管間質(zhì)異常[2]。狼瘡性腎炎與小管間質(zhì)病變的關(guān)系比與腎小球纖維化的關(guān)系更密切,腎小管和腎間質(zhì)是其主要靶點(diǎn)[3]。腎臟中成熟的腎小管上皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腎臟中高糖毒性的特征表現(xiàn),且與腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展高度相關(guān)[4]。腎小管上皮細(xì)胞可通過EMT轉(zhuǎn)為肌成纖維細(xì)胞,進(jìn)入間質(zhì)合成細(xì)胞外基質(zhì),阻斷EMT可以抑制疾病進(jìn)程[5,6]。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白(NGAL)及其受體(NGALR)均屬于糖蛋白的一種,并且與先天免疫系統(tǒng)有關(guān),已在多種疾病中檢測(cè)到表達(dá)水平增加,被證明可預(yù)測(cè)腎小管損傷[7]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,狼瘡性腎炎患者血液、尿液及腎組織中NGAL和NGALR表達(dá)水平顯著高于非狼瘡性腎炎患者,且尿液中NGALR的表達(dá)水平與狼瘡活動(dòng)指標(biāo)呈正相關(guān)[8]。有研究證實(shí)NGAL可調(diào)控NF-κB/Snail信號(hào)通路上游啟動(dòng)子[9],而激活的NF-κB通路能誘導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)直接參與狼瘡性腎炎和EMT[10,11]。但NGALR對(duì)NF-κB的調(diào)控作用及在狼瘡性腎炎中的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究通過構(gòu)建NGALR干擾表達(dá)載體,結(jié)合NF-κB通路抑制劑,基于高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞評(píng)估NGALR通過調(diào)控NF-κB通路對(duì)細(xì)胞EMT的影響。探討NGALR在腎小管上皮細(xì)胞表型變化中的作用,進(jìn)一步闡明NGAL/NGALR對(duì)狼瘡性腎炎發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HK-2人腎近曲小管細(xì)胞購自上海賽百慷公司,Defined K-SFM來源于iCell(iCell-h096-001b),胰蛋白酶、CCK8、D-無水葡萄糖、D-甘露醇、Tween-20、RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶公司(T1350、CA1210、G8150、M8140、T8220-100、R0010、PC0020),Trizol購自美國(guó)Ambion公司(15596026),Opti-MEM購自美國(guó)Gibco公司(31985-062),Lipofectamine?RNAiMAX購自美國(guó)Invitrogen公司(13778030),AnnexinV-PE/7 AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)BD公司(559763),PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購于美國(guó)Millipore公司(IPVH00010、WBKLS0500),抗體NGALR、NGAL、p65、p-p65、Snail、Vimentin、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG購于武漢Bioswamp公司(ab124506、PAB33190、PAB33379、ab76302、PAB33921、PAB30841、PAB36269、SAB43714)。倒置熒光顯微鏡來源于Leica公司(DMIL LED),酶標(biāo)儀來源于杭州奧盛公司(AMR-100),流式細(xì)胞儀來源于艾森儀器公司(NovoCyte),熒光定量PCR儀來源于Bio-Rad公司(CFX-Connect 96),全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀來源于上海天能儀器公司(Tanon-5200)。

1.2 篩選高糖誘導(dǎo)細(xì)胞模型構(gòu)建的最佳時(shí)間

HK-2用Defined K-SFM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí),胰蛋白酶消化細(xì)胞,1∶2傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,加入30mM葡萄糖分別誘導(dǎo)12、24、36、48h,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組(5.5mM葡萄糖)和滲透壓組(5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),通過細(xì)胞活性和NGALR mRNA表達(dá)確定高糖誘導(dǎo)最佳作用時(shí)間。與正常對(duì)照組和滲透壓組相比,高糖誘導(dǎo)后各組細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01),NGALR mRNA相對(duì)表達(dá)水平上升(P<0.01)。同時(shí),高糖誘導(dǎo)構(gòu)建模型的時(shí)間為24h時(shí),細(xì)胞增殖能力趨于穩(wěn)定,NGALR mRNA相對(duì)表達(dá)水平最高。因此,高糖誘導(dǎo)細(xì)胞模型構(gòu)建最佳作用時(shí)間為24h。見表1。

表1 高糖誘導(dǎo)對(duì)HK-2細(xì)胞增殖活力和NGALR mRNA表達(dá)的影響

1.3 NGALR干擾慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

基于人NGALR(Gene ID:51310)的序列,構(gòu)建干擾載體(si-NGALR 1、si-NGALR 2、si-NGALR 3)及si-NGALR NC(陰性對(duì)照)。過程為:基因合成目的基因序列,進(jìn)行引物退火獲取基因片段。通過酶切反應(yīng)體系進(jìn)行載體線性化,將雙酶切后的目的基因片段與載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化后進(jìn)行陽性克隆鑒定。將酶切和PCR檢測(cè)均為陽性的克隆子進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與NCBI中基因比對(duì),檢測(cè)是否成功構(gòu)建。待接種于6 孔板的HK-2細(xì)胞融合度為90%時(shí),取質(zhì)粒和Lipofectamine?RNAiMAX分別稀釋于Opti-MEM中,兩者混勻后室溫孵育20min。將復(fù)合物加到含有細(xì)胞和新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,轉(zhuǎn)染4h后換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h。以未轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞為對(duì)照,qRT-PCR檢測(cè)NGALR mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染NGALR干擾慢病毒載體后,對(duì)照組、si-NGALR 1、si-NGALR 2、si-NGALR 3和陰性對(duì)照組細(xì)胞中NGALR mRNA的表達(dá)分別為(1.00±0.09)、(0.58±0.02)、(0.34±0.01)、(0.41±0.01)和(1.03±0.02)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染si-NGALR質(zhì)粒的細(xì)胞NGALR的mRNA相對(duì)表達(dá)均顯著下降(F=181.30,P<0.01),陰性對(duì)照組無顯著變化(P>0.05),即細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染si-NGALR質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6 組:對(duì)照組,正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞;模型組,用30mM高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24h;si-NGALR NC組,先用30mM高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24h,然后再轉(zhuǎn)染si-NGALR NC質(zhì)粒4h;si-NGALR組,先用30mM高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24h,然后再轉(zhuǎn)染NGALR干擾質(zhì)粒4h;PDTC組,先用30mM高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24h,然后加入100μM NF-κB抑制劑PDTC[12];PDTC+si-NGALR組,先用30mM高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24h,然后加入100 μM NF-κB抑制劑PDTC作用1h,再轉(zhuǎn)染NGALR干擾質(zhì)粒4h。各組細(xì)胞均在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

取各組HK-2細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為3×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板,每孔100μl,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞貼壁。用5.5mM葡萄糖和24.5mM甘露醇處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h,向每孔加入10μl CCK8溶液,培養(yǎng)4h。于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值代表細(xì)胞增殖活力。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)NGALR mRNA表達(dá)

收集各組待測(cè)HK-2細(xì)胞,胰蛋白酶消化,離心后加入Trizol提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為95℃ 3min,95℃ 5s,56℃ 10s,72℃ 25s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算NGALR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成,序列為:NGALR-F:GTG AAG CGG CAG ATT GAG;NGALR-R:CAG GCT GGT AGC AGT GGC;GAPDH-F:GGG AAA CTG TGG CGT GAT;GAPDH-R:GAG TGG GTG TCG CTG TTG A。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組待測(cè)HK-2細(xì)胞,取1×106個(gè)培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞,離心重懸于200μl PBS,加入5μl AnnexinV-PE和5μl 7-AAD,輕輕混勻,4℃避光孵育30min,加入300μl PBS,進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.8 Western Blot檢測(cè)p-NF-κB p65、NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL和Vimentin蛋白表達(dá)

收集各組待測(cè)HK-2細(xì)胞,每1×106個(gè)細(xì)胞加入含有200μl蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液,4℃充分裂解細(xì)胞,離心取上清液,用BCA試劑盒定量總蛋白。配置12%的SDS-PAGE凝膠,每孔上樣20μg蛋白進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜。在4℃孵育過夜前,用5%脫脂奶粉室溫下封閉1h。與稀釋后的一抗(1∶1000)孵育1h,用含有Tween-20的PBS洗滌膜三次,并與二抗(1∶20 000)室溫孵育1h。用ECL發(fā)光液與膜接觸檢測(cè)印跡。使用TANON GIS軟件分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖水平比較

各組細(xì)胞增殖水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞增殖活力顯著下降(t=22.03,P<0.01)。與模型組比較,si-NGALR組和PDTC組細(xì)胞增殖活力顯著增加(t=6.38、7.60,P<0.01)。與PDTC組相比,PDTC+si-NGALR組細(xì)胞增殖活力顯著增加(t=4.94,P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖能力和凋亡率

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞凋亡率顯著上升(t=26.03,P<0.01)。與模型組相比,si-NGALR組和PDTC組細(xì)胞凋亡率顯著下降(t=5.17、8.22,P<0.01)。與PDTC組相比,PDTC+si-NGALR組細(xì)胞凋亡率顯著下降(t=3.66,P<0.01)。見圖1和表2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))

2.2 各組細(xì)胞p-NF-κB p65、NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL和Vimentin蛋白表達(dá)水平比較

各組細(xì)胞p-NF-κB p65、NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL和Vimentin蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞中p-NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL及Vimentin蛋白表達(dá)均顯著增加(t=20.08、32.24、44.46、36.06、40.15,P<0.01)。與模型組比較,si-NGALR組和PDTC組細(xì)胞中p-NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL及Vimentin蛋白表達(dá)均顯著下降(t模型組 vs siNGALR組=11.81、5.62、33.02、9.14、11.26,t模型組 vs PDTC組=17.02、14.99、37.27、13.61、20.76,P<0.01)。與PDTC組比較,PDTC+si-NGALR組細(xì)胞中p-NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL及Vimentin蛋白表達(dá)均顯著下降(t=5.21、4.46、5.28、6.08、7.54,P<0.01)。見圖2和表3。

圖2 各組細(xì)胞中p-NF-κB p65、NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL及Vimentin蛋白水平(Western Blot)

表3 各組細(xì)胞中p-NF-κB p65、NF-κB p65、Snail、NGALR、NGAL及Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)表達(dá)變化

3 討 論

由于人口老齡化,腎臟疾病的患病率在世界范圍內(nèi)不斷增加,并導(dǎo)致社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加以及發(fā)病率和死亡率增加。狼瘡性腎炎是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,主要由免疫復(fù)合物在腎小球內(nèi)的形成和沉積引起[13]。目前狼瘡性腎炎的治療主要以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主,但對(duì)部分患者的臨床緩解和復(fù)發(fā)抑制效果差[14]。因此,需要新型的靶向生物制劑準(zhǔn)確及時(shí)地監(jiān)測(cè)狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展。NGAL是早期診斷急性腎損傷和預(yù)測(cè)腎臟預(yù)后的極佳生物標(biāo)志物[15]。與健康對(duì)照相比,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清NGAL水平顯著升高,其中與非狼瘡性腎炎患者相比,狼瘡性腎炎患者的血清NGAL水平顯著更高[16]。NGALR是NGAL特異性受體之一,在NGAL內(nèi)吞過程中起著重要作用。與正常腎組織及其它類型腎小球腎炎相比,狼瘡性腎炎的腎小球中NGALR蛋白表達(dá)明顯增高,陽性染色結(jié)果表明其主要分布在系膜[17]。本研究中,與正常培養(yǎng)的人腎近曲小管細(xì)胞相比,高糖誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞中NGALR蛋白表達(dá)顯著升高,與前期臨床結(jié)果一致[8]。而干擾NGALR的表達(dá)后,與高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞模型相比,細(xì)胞增殖活力上升,凋亡率下降,說明抑制NGALR的表達(dá)能保護(hù)細(xì)胞正常生長(zhǎng),抑制非正常凋亡。

研究表明,EMT是組織損傷后纖維形成的一個(gè)組成部分,在器官纖維化過程中EMT被異常激活,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞附近間充質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的形成,然后聚集和分泌纖維促進(jìn)因子,促進(jìn)組織變性[19]。EMT過程復(fù)雜,在此過程中上皮細(xì)胞失去極性并獲得間充質(zhì)特性[20]。Vimentin、Snail等作為關(guān)鍵誘導(dǎo)因子,以各種組合方式誘導(dǎo)促進(jìn)間充質(zhì)形態(tài)的基因表達(dá),并抑制維持上皮狀態(tài)的基因表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞EMT發(fā)生[21]。Snail活化可以上調(diào)Vimentin進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的改變介導(dǎo)EMT和成年轉(zhuǎn)基因小鼠的腎纖維化[22],而抑制Snail和Vimentin表達(dá)能阻斷EMT過程,降低細(xì)胞纖維化程度[23]。本研究中,干擾NGALR的表達(dá)后,細(xì)胞模型中Snail和Vimentin表達(dá)均下調(diào),說明NGALR沉默抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT過程,從而抑制細(xì)胞異常的表型轉(zhuǎn)變。

在間質(zhì)纖維化、腎纖維化等過程中,NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用[24]。同時(shí),NF-κB信號(hào)通路的過度激活已被確定是EMT的關(guān)鍵誘導(dǎo)物[25]。NF-κB是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、炎癥和存活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥和癌癥的發(fā)展中起著核心作用。Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn),抑制NF-κB活化和p65磷酸化及易位到細(xì)胞核中,能下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物、Snail的蛋白水平,抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖。本研究中,NF-κB抑制劑作用于高糖誘導(dǎo)損傷細(xì)胞模型時(shí),HK-2細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),凋亡率、Snail和Vimentin表達(dá)及NF-κB p65磷酸化水平均下降,且NGALR、NGAL表達(dá)下調(diào)。同時(shí),干擾NGALR的表達(dá)后,HK-2細(xì)胞NF-κB p65磷酸化下調(diào)。這說明NGALR沉默對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,從而抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT過程。

綜上所述,結(jié)合課題組的前期臨床研究,提示NGALR對(duì)狼瘡性腎炎靶向治療具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。其機(jī)制可能是NGALR通過與NGAL結(jié)合,激活HK-2細(xì)胞內(nèi)部NF-κB信號(hào)通路,抑制EMT進(jìn)程,減少HK-2細(xì)胞異常凋亡。