蒼術素調節PINK1/Parkin信號通路對膝骨關節炎大鼠線粒體自噬的影響*

葉海東 劉 宇 甄朋超

膝骨關節炎(Knee Osteoarthritis,KOA)作為一種以軟骨損傷退變為主要病理改變的退行性和慢性關節疾病,仍是導致殘疾和疼痛的主要原因之一,且多發于老年人[1,2]。盡管目前有可用的治療KOA的方法(包括手術和非手術),但其療效仍尚未能滿足醫療需求[3]。因此,開發能夠緩解、阻止甚至逆轉KOA進展的新治療策略一直是廣大臨床和科研工作者的首要任務。近年來,中醫藥作為KOA的常見輔助療法,在KOA治療中顯示出獨特優勢,且其可通過減輕膝關節炎癥、抑制軟骨細胞外基質降解等途徑來緩解KOA[4,5]。蒼術素是一種從菊科植物蒼術或北蒼術的干燥根莖中提取出的有效單體成分,具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性[6,7]。已有研究表明,蒼術素能夠抑制白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的人KOA軟骨細胞炎癥反應[8]。但蒼術素對KOA的作用機制仍未完全明確。線粒體功能障礙可促使軟骨細胞自噬和凋亡之間的失衡,導致軟骨退化,加速KOA進展[9]。此外,促進PINK1/Parkin介導的線粒體自噬可保護骨關節炎中軟骨細胞[10];且增強關節軟骨細胞自噬有助于防止骨關節炎中軟骨細胞凋亡[11]。基于此,本研究通過構建KOA大鼠模型,探究蒼術素對軟骨組織中PINK1/Parkin介導的線粒體自噬的影響,為蒼術素用于KOA臨床治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只SPF級健康雄性SD大鼠(3-4月齡,體質量330-370g)購自北京斯貝福生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。所有大鼠在恒溫(22-23℃)、恒濕(50-60%)的SPF級動物房統一飼養,每天使用燈光控制光照/黑暗(12h/12h),自由進食飲水。本研究動物實驗嚴格遵循3R原則,符合中華人民共和國國家標準《實驗動物福利倫理審查指南》中相關準則。

1.2 主要試劑

碘乙酸鈉、自噬抑制劑3-MA(I9148-5G、189490-100MG)購自美國Sigma公司;蒼術素(B20128-20mg,HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage Oligomeric Matrix Protein,COMP)ELISA試劑盒(E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R0159c)、TUNEL原位細胞凋亡試劑盒(HRP-DAB顯色法,E-CK-A331)以及免疫組化試劑盒(帶DAB顯色液,E-IR-R215)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;改良番紅O-固綠軟骨染色液(G1371)購自北京索萊寶科技有限公司;組織ROS檢測試劑盒(DHE,470515-200T)購自上海雅吉生物科技有限公司;兔源一抗cleaved Caspase-3(PA5-114687)購自美國Invitrogen公司;兔源一抗Beclin1、LC3、GAPDH(ab207612、ab192890、ab181602),鼠源一抗PINK1、Parkin(ab186303、ab77924)以及二抗HRP標記羊抗兔或鼠IgG(ab205718、ab6789)購自英國Abcam公司。

1.3 動物分組、造模與藥物干預

大鼠適應性飼養7天后按隨機數表法分為對照組、模型組、(低、高)劑量蒼術素組和高劑量蒼術素+ 3-MA組,每組16只。除對照組外,其余組大鼠采用關節腔內注射碘乙酸鈉法構建KOA模型[12],具體操作為:大鼠麻醉后,使用30號針頭穿過髕下韌帶注射4mg碘乙酸鈉溶液(將碘乙酸鈉溶解于50μl生理鹽水中)至后肢膝關節腔內。對照組于相同部位注射50μl生理鹽水。

造模3周(經膝關節紅腫、活動受限等情況確認造模成功)后,(低、高)劑量蒼術素組大鼠腹腔注射3mg/kg、6mg/kg蒼術素[13](預實驗已證實,3mg/kg、6mg/kg蒼術素對正常SD大鼠無明顯毒性作用);高劑量蒼術素+3-MA組大鼠腹腔注射6mg/kg蒼術素和15mg/kg 3-MA[14];對照組、模型組注射等量生理鹽水,每天1次,持續給藥3周。

1.4 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平

給藥結束24h后所有大鼠進行麻醉,腹主動脈取血5ml,靜置1h后3 000r/min離心10min,獲取上層血清,參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清TNF-α、IL-1β、COMP水平。

1.5 番紅O-固綠染色檢測大鼠膝關節軟骨組織病理學改變

腹主動脈取血后使大鼠安樂死,打開患肢膝關節腔,小心取出關節軟骨,每組隨機選取8只大鼠的關節軟骨置于4%多聚甲醛固定24h,10% EDTA溶液脫鈣后制備常規石蠟切片(5μm)。將切片脫蠟至水,隨后分別使用Weigent染液、固綠染液染色5min,蒸餾水沖洗后加入番紅O染液孵育2min。光學顯微鏡觀察并拍照,軟骨基質呈紅色。每張切片隨機選取5個視野,根據膝關節軟骨結構(0-6分)、軟骨細胞數量和分布(0-3分)、基質染色(0-4分)、潮線完整性(0-1分)進行Mankin’s評分[15],Mankin’s評分越高,膝關節軟骨退變越嚴重。

1.6 TUNEL染色檢測大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率

將1.5中制備的石蠟切片脫蠟至水,根據TUNEL原位細胞凋亡試劑盒說明,分別添加0.2% Trition X-100、3% H2O2、DNase I、Streptavidin-HRP工作液等試劑進行處理,DAB顯色,蘇木素復染核,在光學顯微鏡下觀察拍照,TUNEL陽性染色細胞即為凋亡細胞(呈棕黃色)。隨機選取6個視野對凋亡細胞和總細胞進行計數(Image-Pro Plus 6.0軟件),計算凋亡率,凋亡率(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.7 DHE熒光探針檢測大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平

將1.5中制備的石蠟切片脫蠟至水,經抗原熱修復、0.2% Trition X-100、3% H2O2處理后添加DHE ROS探針室溫孵育30min,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照(ROS染色呈紅色),并隨機選取6個視野通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分光密度,以單位面積內積分光密度即平均光密度(Average Optical Density,AOD)表示ROS水平。

1.8 免疫組化檢測大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3、LC3陽性表達

將1.5中制備的石蠟切片脫蠟至水后置于枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸進行抗原熱修復,加入3% H2O2滅活內源性過氧化物酶,正常山羊血清封閉后加入兔源一抗(cleaved Caspase-3、LC3抗體)4℃孵育過夜,加入生物素標記二抗37℃孵育30min,DAB顯色,蘇木精復染核。在光學顯微鏡下觀察拍照(陽性細胞呈棕黃色),隨機選取6個視野計數陽性細胞和總細胞(Image-Pro Plus 6.0軟件),計算陽性細胞比例(陽性細胞數/總細胞數×100%)。

1.9 Western Blot檢測大鼠膝關節軟骨組織中自噬以及PINK1/Parkin通路相關蛋白表達

剩余8只大鼠的膝關節軟骨使用RIPA裂解液充分裂解,獲取組織中總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。各樣品取20μg變性蛋白進行SDS-PAGE電泳,并通過電轉移將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉膜2h,膜與一抗(Beclin1、LC3、PINK1、Parkin、內參GAPDH抗體)在4℃下孵育過夜,與對應種屬的二抗在37℃下孵育45min,化學發光試劑顯色。凝膠成像系統掃描圖像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度。以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達水平。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平比較

如表1所示,各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平升高(q均>21.582,P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒼術素組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平均降低(q均>10.320,P<0.05);與高劑量蒼術素組比較,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平升高(q均>12.384,P<0.05)。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平比較

2.2 各組大鼠膝關節軟骨組織病理學改變

番紅O-固綠染色結果顯示(如圖1、表2),對照組大鼠膝關節軟骨表面光滑,細胞排列整齊,基質染色均勻,潮線完整;相比于對照組,模型組大鼠膝關節軟骨層變薄且表面粗糙,出現較多裂隙,細胞排列紊亂且數量減少,基質染色消退,潮線不清晰,同時Mankin’s評分升高(q=20.987,P<0.05);相比于模型組,低、高劑量蒼術素組大鼠膝關節軟骨病理損傷有所減輕,表現為軟骨層變厚且表面更加光滑,裂隙減少,細胞數量增多且排列較有序,基質染色增多,潮線較清晰,同時Mankin’s評分降低(q均>5.865,P<0.05);相比于高劑量蒼術素組,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠膝關節軟骨病理損傷加重,同時Mankin’s評分升高(q=9.521,P<0.05)。

圖1 各組大鼠膝關節軟骨組織病理學改變(番紅O-固綠,×100)

表2 各組大鼠膝關節軟骨Mankin’s評分、細胞凋亡率和ROS水平比較

2.3 各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率比較

如圖2、表2所示,各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率升高(q=11.729,P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒼術素組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率降低(q均>5.368,P<0.05);與高劑量蒼術素組比較,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率升高(q=5.739,P<0.05)。

圖2 各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡情況(TUNEL,×200,凋亡細胞呈棕黃色,細胞核呈藍色)

2.4 各組大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平比較

如圖3、表2所示,各組大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平升高(q=10.735,P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒼術素組大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平降低(q均>4.880,P<0.05);與高劑量蒼術素組比較,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平升高(q=5.855,P<0.05)。

圖3 各組大鼠膝關節軟骨組織中ROS表達(DHE熒光探針,×200,DHE染色細胞呈紅色,細胞核呈藍色)

2.5 各組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3、LC3陽性表達水平比較

如圖4、表3所示,各組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3、LC3陽性表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3、LC3陽性細胞比例均升高(q均>6.648,P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒼術素組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3陽性細胞比例降低,LC3陽性細胞比例進一步升高(q均>8.554,P<0.05);與高劑量蒼術素組比較,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3陽性細胞比例升高,LC3陽性細胞比例降低(q均>12.936,P<0.05)。

圖4 各組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3陽性表達(免疫組化,×200)

圖5 各組大鼠膝關節軟骨組織中LC3陽性表達(免疫組化,×200)

表3 各組大鼠膝關節軟骨組織中cleaved Caspase-3、LC3陽性細胞比例比較

2.6 各組大鼠膝關節軟骨組織中自噬和PINK1/Parkin通路相關蛋白表達水平比較

如圖6、表4所示,各組大鼠膝關節軟骨組織中自噬和PINK1/Parkin通路相關蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠膝關節軟骨組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表達水平升高(q均>5.012,P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒼術素組大鼠膝關節軟骨組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表達水平進一步升高(q均>13.364,P<0.05);與高劑量蒼術素組比較,高劑量蒼術素+3-MA組大鼠膝關節軟骨組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表達水平降低(q均>17.819,P<0.05)。

圖6 各組大鼠膝關節軟骨組織中Beclin1、LC3、PINK1、Parkin蛋白表達(Western Blot)

表4 各組大鼠膝關節軟骨組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表達水平比較

3 討 論

中醫藥治療KOA可減輕膝關節疼痛、改善膝關節功能且不良反應少,為KOA患者提供了潛在益處,并已被接受作為KOA的補充療法[16]。蒼術素作為一種中藥單體,已被證明具有抗炎、抗氧化應激等多種作用[17]。另有研究表明,蒼術素可能是二妙散不同極性溶劑提取物保護佐劑性關節炎大鼠的主要活性成分[18];在小鼠模型中,蒼術素抑制骨髓來源的樹突狀細胞成熟并改善膠原誘導的關節炎[19];蒼術素在IL-1β誘導的人KOA軟骨細胞中發揮抗炎活性[8]。然而,蒼術素對KOA的保護機制尚不完全清楚,有待更深入探究。

KOA是炎癥、氧化應激、細胞外基質降解等多因素導致的膝關節軟骨退變,其中IL-1β、TNF-α是機體細胞產生的致炎細胞因子,在KOA發生發展中具有重要的調節作用,而COMP是軟骨中非膠原蛋白的主要成分,常作為關節軟骨退變的生物標記物[20,21]。本研究結果顯示,KOA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平升高,且膝關節軟骨存在明顯的病理損傷,同時Mankin’s評分升高,表明本研究構建的模型大鼠體內存在炎癥,同時膝關節軟骨發生退變,這與KOA的病理特征相吻合。而蒼術素治療可降低KOA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平和Mankin’s評分,提示蒼術素可減輕KOA大鼠膝關節軟骨退變,并抑制體內炎癥。

此外,軟骨細胞自噬不足和過度凋亡被認為是KOA的重要病理機制,且二者之間的平衡在軟骨退化中起關鍵作用[22]。據報道,增強軟骨細胞自噬并抑制其凋亡可改善KOA[23],而抑制軟骨細胞自噬則加劇KOA[24]。軟骨細胞自噬和凋亡均與線粒體功能障礙密切相關,線粒體功能障礙時線粒體會持續生成大量的ROS,加劇軟骨細胞凋亡,同時為了維持細胞內環境穩定而通過選擇性自噬來降解功能失調或過剩的線粒體,從而維持細胞的正常生命活動,即線粒體自噬[9,25]。本研究中,KOA模型大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平以及細胞凋亡率、線粒體凋亡通路關鍵蛋白cleaved Caspase-3陽性細胞比例均升高,同時自噬標志物LC3陽性細胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平亦升高,表明KOA發生時線粒體受損,促進膝關節軟骨細胞凋亡,同時自噬水平升高,這與Jin等[10]和Hu等[25]研究中KOA模型小鼠或大鼠軟骨細胞凋亡和自噬水平均升高相一致,推測可能的機制是:KOA發生后軟骨細胞通過線粒體自噬以維持線粒體數量和質量與細胞內環境穩定性之間的平衡,但由于軟骨細胞線粒體自噬水平不足,無法有效保護受損細胞,且在ROS等刺激下凋亡細胞持續增多,最終導致軟骨細胞仍處于嚴重損傷狀態。此外,有趣的是,Wang等[26]和Li等[24]研究表明KOA發生后軟骨細胞自噬水平降低,這與本研究結果貌似矛盾,分析原因可能是KOA病因不同或疾病所處階段不同等。進一步分析發現,蒼術素可降低KOA大鼠膝關節軟骨組織中ROS水平以及細胞凋亡率、cleaved Caspase-3陽性細胞比例,但進一步升高了LC3陽性細胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平。提示蒼術素可緩解KOA大鼠膝關節軟骨組織中線粒體功能障礙,減少軟骨細胞凋亡,并增強軟骨細胞自噬。Lv等[27]研究亦表明,槲皮素能夠緩解KOA中軟骨細胞凋亡,并促進軟骨細胞自噬等。

PINK1/Parkin途徑介導的線粒體自噬是哺乳動物系統中研究最廣泛的途徑,其中PINK1是一種蛋白激酶,通過感知殘基狀態來監測線粒體的完整性,而Parkin是一種泛素蛋白連接酶,它將泛素連接到故障線粒體上作為降解信號,兩種酶協同促進受損線粒體的自噬清除(即線粒體自噬)[28]。上調軟骨細胞中PINK1/Parkin依賴性線粒體自噬可對KOA發揮保護作用[29]。本研究結果顯示,KOA模型大鼠膝關節軟骨組織中PINK1、Parkin蛋白表達水平升高,且蒼術素可進一步升高KOA大鼠中PINK1、Parkin蛋白表達水平,其與自噬標記物LC3、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化趨勢相同。表明蒼術素增強KOA大鼠膝關節軟骨細胞線粒體自噬與激活PINK1/Parkin信號通路有關。此外,為進一步驗證線粒體自噬在蒼術素改善KOA膝關節軟骨退變中的作用,本研究在蒼術素干預基礎上添加自噬抑制劑3-MA,結果顯示,3-MA可抑制KOA大鼠膝關節軟骨中PINK1/Parkin信號通路激活和線粒體自噬,同時減弱蒼術素對膝關節軟骨退變、體內炎癥、線粒體功能障礙和軟骨細胞凋亡的改善作用,這進一步證實了蒼術素減輕KOA與激活PINK1/Parkin信號通路并增強膝關節軟骨細胞線粒體自噬有關,這與既往研究中[10,23-27]增強線粒體自噬緩解KOA具有一致性。

綜上所述,蒼術素可能通過激活PINK1/Parkin信號通路增強KOA大鼠膝關節軟骨線粒體自噬,并減少軟骨細胞凋亡,從而改善膝關節軟骨退變。本研究為KOA的治療提供了新思路和實驗基礎。但本研究僅通過大鼠KOA模型進行了初步驗證,后續有待通過體外細胞實驗進一步完善與補充。