小檗堿通過激活肌成纖維細胞鐵死亡減輕腎臟纖維化*

劉 波 王 黎 凌生濤 孫鑫波 姚啟盛

近年來慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)在國內外呈逐年上升趨勢,據不完全統計,我國成人CKD的發病率約為10.8%[1]。腎臟纖維化是所有CKD的共同終點,也是CKD的治療靶點[2]。肌成纖維細胞是驅動纖維化的效應細胞,激活機制復雜且不明確。當前認為,腎纖維化形成主要與肌成纖維細胞及其產生的細胞外基質積聚有關,但肌成纖維細胞的調控還未完全闡明。

鐵死亡是一種新型的程序性細胞死亡,其特征是細胞內鐵超載和脂質活性氧的積累。鐵死亡細胞表現出鐵代謝紊亂、脂質過氧化積累、谷胱甘肽(GSH)和GPX4缺乏[3]。酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)是一種參與脂質代謝的重要酶,被認為是鐵死亡的標記蛋白。鐵死亡與多種人類疾病有關,在多器官疾病中起著重要作用,包括腦、心、腎和肝臟疾病[4,5]。研究表明,鐵死亡在缺血/再灌注誘導的急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)中起重要作用,也是其它AKI模型的致病因素[6-8]。可見,鐵死亡是一個很有前途的治療靶點,但腎臟纖維化過程中是否有鐵死亡發生尚不清楚,其作用也沒有得到充分的研究。

小檗堿(Berberine,BBR)作為黃蓮的主要活性物質之一,是許多疾病的有效治療藥物,包括炎癥、糖尿病和癌癥[9,10]。BBR對腎臟代謝性疾病也有良好的臨床治療效果。Li等[11]和Wang等[12]均發現BBR可顯著降低血清尿酸水平,改善腎臟功能障礙引起的代謝紊亂。但是,目前BBR在腎臟纖維化中的研究報道較少,本研究主要采用單側輸尿管結扎造成梗阻(UUO)建立腎小管間質纖維化實驗動物模型,探討腎纖維化過程中鐵死亡的作用。本研究通過體外和體內實驗證實了BBR對肌成纖維細胞鐵死亡的作用及對腎纖維化的影響,為BBR在腎臟纖維化中的應用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 動物分組及UUO模型建立

40只雄性C57BL/6J 小鼠(20-25g)隨機分為6組:假手術組(Sham組,n=7),模型組(UUO組,n=7),小檗堿假手術組(Sham+BBR組,n=7),小檗堿模型組(UUO+BBR組,n=7),鐵死亡抑制劑模型組(UUO+Fer-1組,n=6),小檗堿+鐵死亡抑制劑模型組(UUO+BBR+Fer-1組,n=6)。通過結扎左側輸尿管引起持續尿路壓力升高建立UUO模型[2]。備皮消毒后在小鼠左腹部切開約1cm左右手術切口,逐層分離腹部組織直至腹腔,醫用棉簽輕輕擠出左腎,找到腎盂并向下游離輸尿管,使用0號絲線于左側輸尿管腎孟結合處以及向下0.3cm左右予以兩處結扎,并在兩處結扎中間段離斷輸尿管,然后逐層縫合關閉腹腔,所有建模小鼠全部建模成功。隨后各組小鼠進行相應藥物干預,持續10天。Sham組只行同樣分離輸尿管處理不予結扎。BBR購自MedChemExpress公司(貨號:2086-83-1),采用灌胃給藥(200mg/kg/天)。鐵死亡抑制劑Fer-1(1mg/kg/天)采用30G大小的胰島素針在尾靜脈儀輔助下行尾靜脈注射。10天后對所有試驗小鼠實施安樂死并留取腎組織進行后續分析。本試驗動物由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。所有動物實驗程序均經中國湖北醫藥學院實驗動物委員會批準,符合國家衛生研究院《實驗動物護理和使用指南》。

1.2 細胞培養及處理

腎肌成纖維細胞(NRK49F)購自武漢普諾賽生命科技有限公司,用10%胎牛血清+1%雙抗+DMEM于 37℃、5% CO2的培養箱中培養。取對數期生長的NRK49F細胞,以1.0×106細胞/皿的密度鋪于35mm培養皿中,當細胞生長密度達到80%—90%時即可進行干預。前期實驗篩選出BBR的最佳作用濃度為50μM,最佳作用時間為48h。將NPK4F9細胞分為:對照組(上述培養液培養)、Fer-1組(上述培養液+1μM Fer-1培養)、鐵死亡激動劑(Erastin)組(上述培養液+5μM Erastin培養)、Erastin+Fer-1組(上述培養液+1μM Fer-1+5μM Erastin培養)、BBR組(上述培養液+50μM BBR培養)和BBR+Fer-1組(上述培養液+50μM BBR+1μM Fer-1培養)。Erastin和Fer-1均用DMSO溶解稀釋至實驗濃度。48h后收集各組細胞,用SDS裂解液提取各組細胞蛋白進行后續實驗。每組重復3次。

1.3 蘇木精-伊紅(HE)、馬松三色(Masson)和免疫組化染色

分別將各組小鼠摘取的腎組織于4℃條件下經生理鹽水灌洗后取部分腎組織放入10%福爾馬林中固定,留取腎皮質部分放入液氮保存,24h后放入-80℃冰箱中凍存備用。

1.3.1 HE染色:取各組小鼠部分腎組織用10%的甲醛固定48h,經梯度酒精脫水后用二甲苯透明30min,石蠟包埋切片,切片用梯度酒精脫蠟后蘇木精染液染色5min,流水沖洗1min,流水沖洗至切片返藍,伊紅染液染色3min,流水洗去伊紅染液后用梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封存,光學顯微鏡下觀察各組腎組織病理改變。

1.3.2 Masson染色:將各組腎臟組織石蠟切片脫蠟后用梯度酒精脫水,將脫水后的腎組織依次經蘇木精、酸性麗春紅、1%磷鉬酸、苯胺藍染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封存。400倍光學顯微鏡下觀察各組腎組織膠原纖維沉積并采集圖像。采用Image J工具計算膠原蛋白面積分數定量間質纖維化,即藍色區域(膠原蛋白)占每個區域總面積的百分比。

1.3.3 免疫組化染色:將腎臟組織切片在10mM檸檬酸鈉、0.05% Tween-20、pH6.0中提取抗原后,通過3%過氧化氫孵育以阻斷內源性過氧化物酶活性,然后加入2.5%正常馬血清以減少非特異性結合。α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗(RnDSystems,MAB1420-SP,1∶20)在4℃孵育過夜。用抗體稀釋劑代替一抗作為陰性對照。光學顯微鏡下觀察各組腎染色情況。α-SMA組化定量分析采用從外髓質和腎皮質區域中每個標本的10個隨機挑選的圖像中計數α-SMA陽性細胞。數據表示為陽性細胞數/mm2。

1.4 鐵、GSH、脂質過氧化和MDA的測定

1.2中細胞裂解離心后收集細胞裂解液的上清液并勻質化。使用鐵測定試劑盒(貨號:ab83366,Abcam)通過比色法測定鐵水平(Fe2+)。使用總GSH/氧化GSH檢測試劑盒(貨號:S0053,上海碧云天生物技術有限公司)通過比色法進行GSH分析。使用脂質過氧化檢測試劑盒(貨號:A106,南京建成生物工程研究所)按照說明檢測細胞裂解液中的脂質過氧化物酶水平。使用脂質氧化(MDA)檢測試劑盒(貨號:S0131S,上海碧云天生物技術有限公司)采用比色法檢測MDA含量。

1.5 Western Blot檢測α-SMA ACSL4和GPX4蛋白

將1.2中收集的蛋白進行免疫印跡分析。用10%SDS-PAGE電泳將蛋白轉移到PVDF膜上,然后用5%脫脂奶粉或者5%BSA進行封閉后,將膜與相應的一抗在4℃搖床孵育過夜。一抗如下:α-SMA(1∶500)、ACSL4(1∶2 000)、GPX4(1∶1 000)和β-actin (1∶5 000)。然后將膜與辣根過氧化物酶HRP標記的二抗在室溫孵育1h。使用ECL化學發光試劑和系統檢測蛋白表達,采用目標蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠腎組織HE染色、Masson染色和α-SMA免疫組化染色結果比較

與Sham組相比,UUO組出現腎小管擴張、刷狀緣丟失(圖1A)、腎臟間質纖維化(圖1B)、α-SMA陽性細胞數增加(t=7.015,P<0.05,表1)。與UUO組相比,UUO+BBR組腎小管擴張和刷狀緣丟失減少(圖1A)、腎臟間質纖維化面積減少(t=5.338,P<0.05,圖1B)、α-SMA陽性細胞數減少(t=9.074,P<0.05,表1)。與UUO+BBR組相比,UUO+BBR+Fer-1組腎小管擴張和刷狀緣丟失增多(圖1A)、腎臟間質纖維化面積增多(t=8.146,P<0.05),α-SMA陽性細胞數減少(t=6.907,P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠腎臟間質纖維化面積(Masson半定量)及α-SMA陽性細胞數比較

2.2 各組NRK49F細胞Fe2+、GSH、MDA、脂質ROS水平比較

各組NRK49F細胞Fe2+、GSH、MDA、脂質ROS水平差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,Fer-1組Fe2+、MDA、脂質ROS降低,GSH的升高;與Erastin組相比,Erastin+Fer-1組Fe2+、MDA、脂質ROS降低,GSH升高;與BBR組相比,BBR+Fer-1組Fe2+、MDA、脂質ROS降低,GSH的升高(t均>8.547,P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞Fe2+、GSH、MDA以及脂質ROS的相對含量均=3)

2.3 各組NRK49F細胞α-SMA、ACSL4和GPX4蛋白水平比較

各組NRK49F細胞α-SMA、ACSL4和GPX4蛋白水平差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,Fer-1組α-SMA蛋白表達降低(t=7.988,P<0.05),GPX4和ACSL4蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。與Erastin組相比,Erastin+Fer-1組α-SMA和GPX4蛋白水平升高,ACSL4水平降低(t均>7.176,P均<0.05)。與BBR組相比,BBR+Fer-1組α-SMA和GPX4蛋白水平增加,ACSL4水平降低(t均>5.623,P均<0.05),見表3。

表3 各組細胞α-SMA、ACSL4和GPX4蛋白水平比較均=3)

3 討 論

CKD是當前比較重要的一個公共衛生問題,它影響著全球約10%以上的人口[13-15]。盡管腎纖維化的形成存在有多種病因,但它是所有類型CKD的最終常見病理改變,且目前還沒有能有效治療腎纖維化的策略。腎間質肌成纖維細胞位于間質中,不但可以通過連接相鄰的腎小管促進組織重構,而且具有調節細胞外基質成分的功能。通常認為肌成纖維細胞是腎纖維化發展的最終執行者[16]。成纖維細胞和腎小管上皮細胞通常相互串擾和傳遞信息,可在生理條件下促進腎臟修復或在不適應條件下加重疾病進展。鐵死亡與腎纖維化之間的關系是一個活躍的研究領域。腎臟是易于發生纖維化的器官之一。在某些慢性腎臟疾病,如慢性腎小球腎炎中,鐵的沉積和代謝紊亂可能與纖維化密切相關。鐵的過度沉積和氧化應激可能引發炎癥反應、細胞凋亡和細胞外基質沉積,從而促進纖維化的發生和進展。鐵死亡與腎纖維化之間存在復雜的關系,鐵死亡在腎纖維化研究中是一個有前途的研究方向,對于更好地了解腎纖維化的發生機制,以及可能的治療方法具有重要意義。

BBR是一種重要的季系苯基異喹啉生物堿,被認為是可以治療多種疾病的天然產物之一[17]。最近有學者發現,BBR有減輕組織器官纖維化的作用,如BBR可通過抑制肝星狀細胞的增殖和細胞外基質的產生減輕肝纖維化[18]。Wang等[12]發現,BBR可通過激活AMPK通路,抑制轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad3信號通路,從而改善與肥胖相關的脂肪組織纖維化。還有研究[19]發現,BBR治療降低了肥胖小鼠的胰島素抵抗,改善了附睪白色脂肪組織纖維化。因此,BBR是一種有前途的治療纖維化疾病的藥物,需要更多的研究來證實其在治療纖維化疾病方面的作用。本研究通過小鼠UUO模型證實了BBR能夠減少腎臟病理損傷、腎臟間質纖維化和α-SMA陽性細胞數(圖1和表1)。體外研究發現,BBR能有效減少腎肌成纖維細胞中α-SMA的表達。表明BBR可能通過抑制腎肌成纖維細胞的活化,減輕小鼠腎小管間質纖維化。

鐵死亡是一種涉及自身免疫性過程的疾病,主要表現為腎臟組織中鐵儲存過多,導致自身免疫性損傷。在某些還原劑的作用下,包括超氧化物(ROS的主要種類),鐵蛋白結合的Fe3+可以被還原為Fe2+,然后從鐵蛋白中釋放出來促進細胞鐵死亡[20]。此外,鐵死亡與代謝和氧化還原信號傳導以及多種病理生理條件有關,包括肝腎等器官的纖維化[21,22]。這與本研究中觀察到的結果是一致的。本研究表2結果顯示,鐵死亡參與BBR介導的腎纖維化減輕腎損傷發生發展過程。證實了BBR可誘導腎肌成纖維細胞鐵死亡,Fer-1可消除BBR的這種作用,進一步表明BBR對腎纖維化的影響是通過調控肌成纖維細胞鐵死亡實現的。

總之,本研究結果證實,BBR可抑制腎肌成纖維細胞的活化并減輕小鼠腎小管間質纖維化;BBR可誘導腎肌成纖維細胞的鐵死亡;Fer-1能有效降低BBR抗腎纖維化的作用。這些結果為BBR在鐵死亡調控中的潛在藥理作用提供了一個視角,并為腎纖維化的治療提供了思路。