基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討腦血疏口服液治療缺血性卒中的作用機(jī)制

惠紅巖，周芳，周祥

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)學(xué)部1、神經(jīng)外科二病區(qū)2，河南 衛(wèi)輝 453100

卒中分為出血性卒中和缺血性卒中，后者是主要的卒中類(lèi)型(占60%～80%)。腦血疏口服液說(shuō)明書(shū)推薦適應(yīng)證中僅有出血性中風(fēng)，無(wú)缺血性中風(fēng)。齊江彤等[1]研究發(fā)現(xiàn)，腦血疏口服液對(duì)缺血性卒中的腦血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)功能、生活質(zhì)量、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凝血功能均有改善作用；吳江瑩等[2]發(fā)現(xiàn)，腦血疏口服液對(duì)急性缺血性腦卒中患者的血脂、纖維蛋白原(FIB)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)改善顯著；作用機(jī)制尚不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討腦血疏口服液在缺血性卒中治療中的有效活性成分及作用機(jī)制等，為促進(jìn)臨床合理用藥、增加缺血性卒中適應(yīng)證的可能性提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 有效化學(xué)成分收集、篩選 通過(guò)TCMSP及文獻(xiàn)收集所包含的7味中藥的化學(xué)成分[3-4]，并通過(guò)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)(OB≥30%)和類(lèi)藥性(drug likeness，DL)(DL≥0.18)進(jìn)行篩選(水蛭除外)。

1.2 藥物活性成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)分析 通過(guò)PubChem 和SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息并進(jìn)行過(guò)濾；通過(guò)HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得水蛭素靶點(diǎn)基因。通過(guò)GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以“cerebral arterial thrombosis”、“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞，獲得缺血性腦卒中相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并進(jìn)行去冗余。

1.3 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選腦血疏口服液治療缺血性卒中的主要活性成分、作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件。

1.5 生物功能注釋與通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能注釋和富集分析。

1.6 有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接分析 選擇最重要的候選活性化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接：(1)使用Chemoffice 15.1軟件將2D結(jié)構(gòu)以最小能量轉(zhuǎn)為3D結(jié)構(gòu)并導(dǎo)出；(2)應(yīng)用PyMOL2.5.1 軟件，進(jìn)行氫化、受體蛋白脫水等初步處理；(3)利用AutoDock Vina1.1.2軟件，將蛋白受體與腦血疏口服液中的活性化合物的小分子配體對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 腦血疏口服液活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 得到腦血疏口服液7種單味藥的潛在活性成分及123個(gè)無(wú)冗余的藥物潛在靶點(diǎn)(除外無(wú)靶點(diǎn)者)，得到2 687個(gè)無(wú)冗余的缺血性腦卒中靶點(diǎn)。

2.2 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將藥物潛在靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)匹配分析取交集、剔除重復(fù)，最終得到共有靶點(diǎn)67個(gè)(圖1)。構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖2)：將腦血疏口服液主要單味藥成分、活性化合物及67個(gè)共有靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到103 個(gè)節(jié)點(diǎn)，195 條邊，包括7 個(gè)單味藥，29 個(gè)活性成分(表1)，67 個(gè)作用靶點(diǎn)。每個(gè)活性成分平均與6.62個(gè)作用靶點(diǎn)相互作用，高于平均度值的活性成分有11 個(gè)，排名前6 的是山柰酚(kaempferol)、β-胡蘿卜苷(beta-daucosterol_qt)、胡蘿卜苷(Daucosterol_qt)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(betasitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，其度值分別為45、11、10、10、9、9；而牛膝和黃芪是度值最高的兩個(gè)單味藥，分別為10 和9。每個(gè)作用靶點(diǎn)平均與2.29 個(gè)活性成分相互作用，高于平均度值的靶點(diǎn)有16 個(gè)：NR1H3的互作活性成分最多，度值為11；CYP19A1、HMGCR、RORC 度值均為9；AR、CYP17A1、SREBF2 度值均為8。這些單味藥和活性成分可能是腦血疏口服液治療缺血性腦卒中中發(fā)揮重要作用的主要成分，而這些靶點(diǎn)可能是其主要作用靶點(diǎn)。

表1 腦血疏口服液7味中藥的29種活性成分Table 1 29 active ingredients in Naoxueshu oral liquid of 7 traditional Chinese medicines

圖1 韋恩圖Figure 1 Venn diagram

圖2 腦血疏口服液治療缺血性卒中的“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 "Single drug-active ingredient-target"network of Naoxueshu oral liquid in the treatment of ischemic stroke

2.3 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)67個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。剔除孤立靶點(diǎn)，PPI網(wǎng)絡(luò)包含61個(gè)節(jié)點(diǎn)，平均度值11.31，度值大于均值的靶點(diǎn)22個(gè)：AKT1(48)、PTGS2 (33)、EGFR (31)、SRC (30)、ESR1 (28)、MMP9 (28)、IL2 (21)、KDR (20)、MMP2 (20)、AR (19)、PIK3R1 (19)、IGF1R (17)、GSK3B (16)、ABCB1 (15)、MET (15)、MPO (15)、PTK2 (15)、ABCG2 (14)、ESR2(14)、HSPA5 (14)、PTPN1 (14)、CYP19A1 (13)。這些靶點(diǎn)的相互作用可能是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Protein interaction network diagram

2.4 分子對(duì)接 分子對(duì)接山柰酚與PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)AKT1、PTGS2、EGFR、SRC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚與AKT1 的結(jié)合勢(shì)能最低(-9.3 kcal·mol)，其次是SRC (-9.1 kcal·mol)、PTGS2 (-8.6 kcal·mol)和EGFR(-7.8 kcal·mol)，見(jiàn)表2。山柰酚與以上四個(gè)靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化(當(dāng)結(jié)合能≤-7.00 kcal/mol時(shí)，表明配體和受體蛋白間的結(jié)合活性很強(qiáng)[5-6]，見(jiàn)圖4。

表2 山柰酚與top 4靶點(diǎn)的分子對(duì)接Table 2 Molecular docking of kaempferol with top 4 target

圖4 山柰酚與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接Figure 4 Molecular docking of kaempferol with core targets

2.5 作用靶點(diǎn)的功能、通路的注釋與富集分析結(jié)果 對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行功能、通路的注釋與富集分析，以期揭示腦血疏口服液在缺血性卒中治療中的可能機(jī)制，為臨床合理用藥提供支持。GO 注釋富集共得到3 413 個(gè)條目：與分子功能(MF)相關(guān)的有313 個(gè)，與細(xì)胞組分(CC)相關(guān)的有210 個(gè)，與生物過(guò)程(BP)相關(guān)的有2 890 個(gè)。分別選擇富集顯著性前20 的條目進(jìn)行可視化(圖5A～5C)。在分子功能中，腦血疏口服液治療缺血性卒中功能主要集中在血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、鐵離子結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、氧化還原酶、單氧酶活動(dòng)、絲氨酸水解酶活性、磷酸酶結(jié)合、激素結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、胰島素受體結(jié)合、類(lèi)固醇結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性等(圖5A)；在細(xì)胞組分中，主要集中在囊泡腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、細(xì)胞膜組分、黏著斑等(圖5B)；在生物過(guò)程中，主要集中在細(xì)胞對(duì)化學(xué)成分的反應(yīng)、類(lèi)二十糖苷代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)體液水平、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等(圖5C)。KEGG 通路注釋與富集共得到165 個(gè)通路，選擇富集顯著性前20 的通路進(jìn)行可視化(圖5D)，腦血疏口服液治療缺血性卒中的相關(guān)通路主要集中在內(nèi)分泌抗性、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性、雌激素信號(hào)通路、卵巢類(lèi)固醇合成、PI3K-Akt 信號(hào)通路等。其中，雌激素信號(hào)通路和PI3K-Akt 信號(hào)通路的通路圖如圖6 和圖7 所示。

圖5 作用靶點(diǎn)的功能與通路富集分析Figure 5 Target function and pathway enrichment analysis

圖6 雌激素信號(hào)通路圖Figure 6 Estrogen signaling pathway

圖7 PI3K-Akt信號(hào)通路圖Figure 7 PI3K-Akt signaling pathway

3 討論

本研究系統(tǒng)分析了腦血疏口服液在缺血性腦卒中治療中的有效活性成分，構(gòu)建的“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中包括7 個(gè)單味藥的29 個(gè)有效活性成分，起關(guān)鍵作用的單味藥主要是黃芪和牛膝，關(guān)鍵的活性成分是山柰酚、β-胡蘿卜苷等。

黃芪具有行滯通痹的作用，能補(bǔ)氣以行血，補(bǔ)氣以通痹，可以調(diào)節(jié)腦血管供血不足，對(duì)于痹癥、中風(fēng)后遺癥等有一定的治療作用。其活性成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芪甲苷等通過(guò)作用于細(xì)胞凋亡等方面的靶點(diǎn)，干預(yù)細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮血管生成，激活補(bǔ)體等疾病代謝途徑，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)，在缺血性腦卒中的預(yù)防和治療中，作用良好[7-8]。牛膝的功效有逐瘀通經(jīng)，引血下行等，還具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[9]。

黃芪、牛膝、牡丹皮、石菖蒲中均含有的山柰酚，是一種具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等作用的化合物[10-12]。山柰酚能夠減輕腦卒中后的梗死面積，預(yù)防給藥能有效改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，具有潛在的預(yù)防和治療卒中的作用[13-14]。牛膝中含有β-胡蘿卜苷，大黃中含有胡蘿卜苷，胡蘿卜苷可以上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD2)等的mRNA 水平，還能提高HO-1 的蛋白含量[15]，進(jìn)而提高氧和葡萄糖剝奪及模擬再灌注處理后的皮層神經(jīng)元的存活率等，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的山柰酚、β-胡蘿卜苷等可能的活性作用，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

該藥在缺血性卒中的治療中，涉及多個(gè)靶點(diǎn)，共有靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)提示，AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等靶點(diǎn)在缺血性卒中的預(yù)防和治療過(guò)程中，可能發(fā)揮著重要的作用。AKT1在缺血腦復(fù)灌時(shí)，磷酸化Akt明顯高表達(dá)[18]。非受體酪氨酸激酶SRC 參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括基因轉(zhuǎn)錄、黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和血管生成等，與缺血性卒中中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的血管通透性增加和小鼠永久性局灶性腦缺血后的腦損傷相關(guān)[19-20]。PTGS2能夠參與介導(dǎo)腦缺血后的炎性反應(yīng)[21]。EGFR 有助于副炎性調(diào)節(jié)異常，與心血管功能障礙和重塑、腦損傷相關(guān)[22-23]。因此，腦血疏口服液中的活性成分可能是通過(guò)作用于以上靶點(diǎn)起治療作用。此外，在分子對(duì)接分析中發(fā)現(xiàn)，山柰酚與AKT1、SRC、PTGS2和EGFR具有較好的結(jié)合能力，說(shuō)明關(guān)鍵活性成分山柰酚通過(guò)與這些靶點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮作用可能是腦血疏口服液治療缺血性卒中的重要機(jī)制之一。

將以上靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和富集分析，共得到165個(gè)通路，涉及多個(gè)生物過(guò)程與分子功能。PI3K-Akt信號(hào)通路是參與缺血性卒中后細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，激活該信號(hào)通路，可對(duì)急性腦梗死后腦損傷起到保護(hù)作用[24]。如前所述，EGFR與腦損傷相關(guān)，推測(cè)腦血疏口服液的活性成分可能通過(guò)EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性通路發(fā)揮一定作用。缺血性腦卒中的發(fā)生中，首要原因是動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)頸動(dòng)脈狹窄而導(dǎo)致，而該進(jìn)程是由AGE-RAGE 信號(hào)通路參與的[25]，AGE-RAGE信號(hào)通路中也有5個(gè)靶點(diǎn)基因富集。

綜上所述，本研究預(yù)測(cè)了腦血疏口服液中包括山柰酚、β-胡蘿卜苷、胡蘿卜苷等在內(nèi)的多種活性成分，作用于AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激應(yīng)答、VEGF 信號(hào)通路、激酶活性等多種通路或生物過(guò)程、功能，通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)防治缺血性卒中的分子機(jī)制，為其增加缺血性卒中這一臨床適應(yīng)證的可能性，提供理論依據(jù)，相關(guān)結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證及臨床研究來(lái)證實(shí)。