血清miR-200a、miR-152水平與妊娠滋養細胞腫瘤化療患者預后的關系

吳靜 趙妍 張珂 楊景 孟勝君

湖南省婦幼保健院婦科 （長沙 410000）

妊娠滋養細胞腫瘤（gestational trophoblastic neplasma，GTN）是胚胎滋養細胞異常增殖形成的腫瘤，是一種較為罕見的惡性婦科腫瘤疾病［1-2］。GTN的診斷和療效評估在大多數情況下是通過監測血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）和組織學證據來進行的，但影響其水平高低的因素眾多［3］。特異性生物標志物越來越多的被用作鑒別診斷和預后評估，從而為GTN帶來不同的治療方案和預后［4］。既往研究缺乏時效性強且便捷的GTN預后評估方法，因此相關血清生物標志物的探討十分重要。WU等［5］研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）-200a在妊娠期高血壓疾病患者中表達上調，且可通過靶向下游基因促進滋養層細胞增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡。既往研究顯示，miR-152表達增加可促進滋養層細胞的凋亡［6］。上述研究中miR-200a、miR-152均與滋養層細胞的生物學行為有關，但二者在GTN中的表達情況及臨床作用仍不十分明確。因此，本研究通過探究GTN患者化療期間血清miR-200a、miR-152的表達水平變化，以期為改善預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料樣本量計算：利用PASS15軟件進行樣本量計算，雙側檢驗，設OR= 2，α = 0.05，power = 90%，計算得到觀察組和對照組各79例，考慮可能有失訪人數，失訪率按20%計算，則觀察組和對照組至少需要95例。采用病例對照研究選取2019年6月至2022年12月期間本院就診且行甲氨蝶呤（MTX）方案方案化療的100例GTN患者為觀察組，選取同期體檢健康女性103例為對照組，對照組年齡、妊娠史與觀察組匹配。研究對象本人已提供知情同意書，本研究獲取醫院倫理委員會批準，倫理批號：2020-S037。

觀察組納入標準：（1）臨床特征、影像學檢查、病理診斷確診，符合其診斷標準［7］，既往均無妊娠期高血壓；（2）患者化療過程中依從性高，且無過敏反應；（3）年齡≥18周歲，臨床資料完整；（4）精神狀態正常，可正常溝通交流。排除標準：（1）伴其他類型惡性腫瘤者；（2）免疫功能紊亂、臟器功能異常者；（3）合并其他可引起血清HCG水平異常的疾病者。對照組納入標準：年齡≥18周歲，臨床資料完整，體檢結果顯示體格健康，無GTN或其他器質性疾病，精神狀態正常，可正常溝通交流。排除標準：已參加其他研究。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集收集GTN化療患者年齡（＜ 40歲，≥ 40歲）、收縮壓、舒張壓、距前次妊娠間隔時間（＜ 7個月，≥ 7個月）、前次妊娠性質（足月妊娠，流產，異位妊娠，葡萄胎）、病灶數（＜ 5個，≥ 5個）、病灶直徑（＜ 5 cm，≥ 5 cm）、臨床分期（Ⅰ+Ⅱ，Ⅲ+Ⅳ）、國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）預后評分（＜ 7分，≥ 7分）、化療前血HCG水平（＜ 10 000 U/L，≥ 10 000 U/L）。

1.2.2 血清miR-200a、miR-152表達水平檢測采集對照組體檢時及觀察組治療前、化療第1個療程、化療第3個療程空腹靜脈血樣5 mL，靜置離心（3 500 r/min，10 min）并收集上層血清，-80 ℃保存待測。采用Trizol試劑（上海齊源生物科技有限公司，貨號：QYK-12830）提取各血清樣本中總RNA，測定純度與濃度后，依照反轉錄試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，貨號：mlE6067）操作說明將其反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測血清miR-200a、miR-152表達水平，miR-200a上游引物5'-CGCATGCGCACTACTGACGAC-3'，下游引物5'-CTCTGTAGCGATCACGTCGTCG-3'；miR-152上游引物5'-CGCACGCTCTACGAGGA-CGA-3'，下游引物5'-TGAAGTAGTCGTACGCAGC-CT-3'；U6上游引物5'-GGACGTGGCGCTAGCGC-CA-3'，下游引物5'-CACGTCTGTACCACAGTCGA-C-3'。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40個循環。循環結束后采用2-ΔΔCT法計算血清miR-200a、miR-152的相對表達量。

1.2.3 療效評估及預后分組MTX方案，MTX 0.4 mg/（kg·d）肌內注射，1次/d，連續5次；亞葉酸鈣0.1 mg/（kg·d）于MTX注射24 h后肌肉注射，1次/d，連續5次，療程間隔為2周，治療3個療程及以上。于化療3個療程后對患者進行評估，進展：病灶增大或轉移，血清HCG水平與治療前比較無顯著變化或呈升高趨勢；無變化：病灶縮小面積小于一半，血清HCG水平降低但仍處于異常情況；部分緩解：病灶面積縮小一半以上，血清HCG水平呈對數降低；完全緩解：各項臨床癥狀消失，血清HCG水平恢復正常。根據化療療效將患者分為預后良好組（完全緩解+部分緩解）80例和預后不良組（進展+無變化）20例。

1.3 統計學方法采用IBM公司SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。計量資料經檢驗后服從正態分布，采用（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，不同化療時間比較采用重復測量方差分析；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預后不良的預測價值，曲線下面積（area under curve，AUC）比較行Z檢驗；GTN化療患者化療后預后不良與各指標的關系采用logistic回歸分析。P＜ 0.05則表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與觀察組血清miR-200a、miR-152表達水平比較觀察組血清miR-200a［（2.68 ± 0.62）vs.（1.02 ± 0.24）］表達水平高于對照組，miR-152［（0.68 ± 0.18）vs.（1.03 ± 0.22）］表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

2.2 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較隨化療時間延長，預后良好組與預后不良組血清miR-200a表達水平依次降低，miR-152表達水平依次升高（P＜ 0.05）。預后不良組治療前、化療第1個療程、化療第3個療程的血清miR-200a表達水平高于預后良好組，miR-152表達水平低于預后良好組（P＜ 0.05）。重復測量方差分析結果顯示，血清miR-200a、miR-152表達水平不同交互、時間及組間作用比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

表1 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

注：與同組化療前比較，aP＜0.05；與同組化療第1個療程比較，bP＜0.05

組別例數miR-200a/U6化療前2.61 ± 0.59 2.94 ± 0.64 F交互 = 61.173、F時間 = 42.990、F組間 = 26.479 P交互 ＜ 0.001、P時間 ＜ 0.001、P組間 ＜ 0.001預后良好組預后不良組F值P值80 20化療第1個療程2.21 ± 0.38a 2.54 ± 0.55a化療第3個療程1.82 ± 0.33ab 2.20 ± 0.40ab化療第1個療程0.82 ± 0.20a 0.55 ± 0.18a化療第3個療程0.97 ± 0.21ab 0.68 ± 0.17ab--miR-152/U6化療前0.74 ± 0.19 0.43 ± 0.16 F交互 = 16.880、F時間 = 24.531、F組間 = 106.537 P交互 ＜ 0.001、P時間 ＜ 0.001、P組間 ＜ 0.001

2.3 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預后不良的預測價值以化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯合預測概率值為檢驗變量，以GTN化療患者是否發生預后不良為狀態變量繪制ROC曲線，結果顯示，化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯合預測GTN化療患者預后不良的AUC分別為0.793、0.844、0.887，聯合預測AUC顯著高于單獨預測AUC（Z= 3.021、2.027，P＜ 0.05）。見圖1、表2。

圖1 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平預測GTN化療患者預后不良的ROC曲線Fig.1 Receiver operating characteristic of serum miR-200a and miR-152 expression levels predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients before chemotherapy

表2 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯合預測GTN化療患者預后不良的價值Tab.2 Value of predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients with serum miR-200a and miR-152 expression levels before chemotherapy alone and in combination

2.4 GTN化療患者化療預后不良的單因素分析單因素分析結果顯示，預后良好組與預后不良組年齡、收縮壓、舒張壓、距前次妊娠間隔時間、前次妊娠性質、病灶數、病灶直徑、臨床分期比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。預后良好組與預后不良組FIGO預后評分、化療前血HCG水平比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 GTN化療患者化療預后不良的單因素分析Tab.3 Single factor analysis of poor chemotherapy prognosis in GTN chemotherapy patientsxˉ±s

2.5 GTN化療患者化療預后不良與各指標關系的logistic回歸分析以GTN化療患者化療后是否預后不良（是=1，否=0）為因變量，將單因素分析結果中差異有統計學意義的miR-200a（連續變量）、miR-152（連續變量）、FIGO預后評分（≥ 7分 = 1，＜7分 = 0）、化療前血HCG水平（≥ 10 000 U/L = 1，＜10 000 U/L = 0）作為自變量進行logistic回歸分析，結果顯示，miR-200a、miR-152、FIGO預后評分≥7分與GTN化療患者預后不良有關（P＜ 0.05）。見表4。

3 討論

妊娠滋養細胞疾病是胚胎滋養細胞進入子宮肌層后轉移至其它組織引起組織破壞或發生惡性增殖的一類婦科惡性腫瘤，包括良性葡萄胎和惡性GTN［8］。GTN包括絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎及中間型滋養細胞腫瘤等［9］。FIGO預后評分根據腫瘤侵犯的解剖部位將GTN患者進行危險分層，但其評分系統中關于低位分組范圍問題存在很大爭議［10］。

既往研究表明，miRNA在多種疾病的發生和發展中發揮著至關重要的作用，包括心血管疾病、腫瘤、內分泌紊亂和妊娠相關疾病［11-14］。近期研究揭示了部分miRNA的異常表達對滋養層細胞的凋亡、增殖、侵襲及血管生成有重要影響［15，16］。miR-200a作為miR-200家族重要成員之一，可通過調控上皮間質轉化過程在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移過程中起關鍵作用［17-19］。劉瑩等［20］研究顯示，miR-200a-3p可靶向轉甲狀腺素蛋白影響妊娠期高血壓疾病滋養細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為。本研究結果顯示，GTN患者血清miR-200a水平高于健康女性。提示miR-200a高表達在GTN的發生發展過程中可能發揮促進作用，基于既往研究推測細胞內環境被打破后，miR-200a表達水平出現顯著升高，miR-200a可通過影響細胞黏附、激活等作用參與GTN患者機體病理生理過程，尤其在細胞增殖和侵襲方面，與劉瑩等［20］研究結論相似。然而許多研究表明，miR-200a在多數腫瘤中表達下調，可抑制細胞增殖、遷移等生物學過程，發揮抑癌基因作用［21-22］。本研究結果與其結論相反，推測miR-200a在不同腫瘤的發生發展中可能發揮不同作用，有待相關基礎研究進一步驗證。近年來發現miR-152是miRNA家族中與細胞增殖、分化、凋亡關系密切的成員之一［23-25］。本研究結果中，GTN患者血清miR-152低表達。基于既往研究中miR-152與細胞生物學行為的關系推測：miR-152參與GTN滋養細胞惡性增殖的作用機制可能同樣與上皮間質轉化有關，miR-152病理性低表達可能造成滋養細胞轉化為具有間質表型的細胞，其細胞黏附功能及極性下降，惡性增殖、遷移及侵襲的能力增加。

此外，本研究結果中化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預后不良有重要預測價值，經化療治療后二者在不同預后患者中的表達水平趨勢不變。表明治療前miR-200a高表達、miR-152低表達可能影響治療GTN的療效和預后，臨床中可通過檢測治療前血清miR-200a、miR-152表達水平對患者預后進行及時預測，對于預測結果顯示為預后不良高危患者，可考慮從單藥方案轉為依托泊苷、MTX、Act-D、環磷酰胺和長春新堿聯合化療，甚至考慮行全子宮雙側輸卵管切除術。患者血清miR-200a高表達、miR-152低表達表明其腫瘤惡性風險較大，炎癥反應大，滋養細胞惡性轉化能力強，進而影響化療療效，不利于預后。

綜上，血清miR-200a表達升高、miR-152表達降低可能不利于GTN化療療效提升，并提示GTN患者預后不良。本研究創新性：既往研究缺乏時效性強且便捷的GTN預后評估方法，而本研究以血清生物指標miR-200a、miR-152作為GTN化療預后的預測指標，其檢測快速便捷、時效性高、價格低廉，臨床醫生可通過早期密切觀察miR-200a、miR-152水平變化，將其作為依據有效地進行預后評估并選擇最佳的治療方案，提高受影響婦女的總體生存率。不足之處：本研究樣本較小，且預后不良與預后良好組病例數差異較大，統計學結果可能存在偏倚。今后進一步的研究中將驗證miR-200a和miR-152作為預后標志物的效果，并建立獨立的驗證集來驗證二者預后價值；此外今后將通過更大樣本量的臨床研究及相關動物細胞實驗證實miR-200a表達升高、miR-152表達降低是否與滋養細胞增殖侵襲相關。