清疕膏外用對銀屑病樣小鼠模型皮損及VEGF表達影響的實驗研究*

包海蘭 朱 赟 徐 偉

銀屑病是一種常見的免疫炎癥性皮膚病,其患病率為0.1%～3.0%[1],發病機制尚不清楚,主要涉及免疫系統紊亂、血管新生和角質形成細胞(Keratinocytes,KC)增生、皮膚屏障功能受損等多個環節。其病理表現以KC的增殖、分化異常,角化不全區中性粒細胞聚集引起Munro微膿腫,真皮淺層毛細血管擴張及周圍可見淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤為主要特征。銀屑病皮損處最先發生的是血管分布和形成異常。血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF) 在血管生成過程中起重要調控作用。異常增殖的KC通過釋放VEGF、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-23(IL-23)等促進皮膚血管的扭曲、增生及中性粒細胞向皮膚中的募集,進一步加劇炎癥,誘導炎性細胞在銀屑病皮損處聚集引起表皮過度角化。

目前西醫用于治療銀屑病外用藥物種類多樣,但相當一部分患者仍然存在外用藥物的刺激性反應或者耐藥現象,且部分藥物的不良作用,其使用的安全問題也不容小覷。特別是銀屑病進行期患者,此期皮損較敏感,常伴有“同形反應”,故應用外用藥不當更易激惹皮損,加重病情。本研究以清疕膏外用干預銀屑病樣小鼠皮損,觀察銀屑病樣小鼠皮損及細胞因子VEGFmRNA及蛋白表達水平的變化,探討清疕膏治療銀屑病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Balb/c 雄性小鼠32只,8～12周齡,體質量18～20 g,均為無特定病原體動物(Specific Pathogen Free,SPF),由北京維通利華實驗動物有限公司提供,動物許可證編號SCXK(京)2016-0006。

1.2 實驗藥物咪哇莫特乳膏(四川明欣藥業有限責任公司產品)清疕膏(地榆、牡丹皮、苦參等,加入凡士林基質,中藥材統一由內蒙古自治區人民醫院中藥房提供)。

1.3 主要試劑和儀器兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)(中杉金橋生物技術有限公司);兔抗血管內皮生長因子多克隆抗體(ab46154)(Abcam公司);Trizol試劑(15596-026)、TaKaRa 逆轉錄試劑盒(RR047A)(日本Takara公司);SYBRTMSelect Master Mix(4472908),美國應用生物系統公司);PCR擴增儀ABI9700PCR(美國ABI公司);PCR擴增儀Agilent Mx3000P(美國Agilent公司);-80 ℃冰箱、恒溫箱3111(美國Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 銀屑病樣小鼠模型的制備BALB/c小鼠,刮除其背部毛發,形成約2 cm×3 cm大小的暴露區域,飼養1 d 后采用數字表法隨機分為4組:空白對照組、模型組、清疕膏組及基質對照組,每組8 只。除空白對照組外均予以造模,定時在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏 62.5 mg,每日1次,在實驗天數內涂抹于小鼠背上暴露區皮膚,連續給藥。

1.4.2 藥物干預模型組: 每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg; 正常對照組: 每日在小鼠裸露背部涂抹等量凡士林;治療組(清疕膏):每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,同時間隔6 h涂抹清疕膏;安慰劑組(凡士林基質):每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,同時間隔6 h涂抹凡士林基質。

1.4.3 標本采集各組造模當天給藥,連續7 d,于第8天取材。按照九格法各組剪取相對應皮損處組織,將其分為2個部分:一部分固定4%多聚甲醛溶液,一部分存于凍存管置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4.4 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行統計數據分析,計量資料采用“均數±標準差”表示,對計量資料進行正態性檢驗,并描述均數、標準差、中位數、最小值、最大值。正態分布的數據,2組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較且方差齊采用One-Way ANOVA進行方差分析,非正態分布的數據采用非參數檢驗,顯著性檢驗水平α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠銀屑病樣皮損癥狀及嚴重程度指數評分比較空白對照組小鼠表現為皮膚表面光滑嫩薄,無鱗屑、紅斑及浸潤增厚等變化;與對照組相比,模型組小鼠皮膚隨著時間逐漸出現了紅斑、鱗屑及浸潤增厚等改變,紅斑出現較早,鱗屑由細小逐漸變成大塊鱗屑,形成典型的PS樣小鼠模型;清疕膏組小鼠隨時間增加表現為輕度紅斑、鱗屑及浸潤肥厚;基質對照組小鼠皮損嚴重程度介于模型組和清疕膏組之間。根據改良小鼠銀屑病面積和疾病嚴重程度指數(Psoriasis Area and Severity Index,PASI) 評分法,每日照相并記錄觀察銀屑病樣小鼠皮損的動態變化,借鑒臨床上使用的PASI 評分標準,應用改良PASI評分法評估小鼠皮膚炎癥的嚴重反應程度。實驗期間由同一人進行評估。評估內容包括:紅斑、鱗屑和增厚。評分標準如下:0:無現象;1:輕度;2:中度;3:重度;4:極重度。總積分為紅斑、鱗屑以及增厚各項評分之和,對各組小鼠總積分取平均值進行評估炎癥嚴重反應程度并繪制皮損積分趨勢圖。各干預治療組積分在實驗期間均小于模型組。其中,清疕膏組紅斑及浸潤積分在7 d內都較低,鱗屑的積分在4 d后趨于平穩;基質對照組各項評分均值介于清疕膏和模型組之間。

2.2 qPCR WB法檢測各組小鼠皮損組織VEGFmRNA及蛋白表達水平模型組銀屑病樣小鼠皮損中VEGFmRNA的相對表達量明顯高于空白組,清疕膏組銀屑病樣小鼠皮損中VEGF相對表達量均低于模型組和基質對照組(P<0.05)。模型組小鼠皮損中VEGF的蛋白表達量較空白組顯著增高,清疕膏組皮損中VEGF蛋白表達量較模型組和基質對照組蛋白表達量減少,差異具有統計學意義。見表1。

表1 各組小鼠皮損組織中VEGF基因及蛋白表達量比較 (只,

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病,以紅斑、鱗屑、增厚為主要特征,其發病機制復雜,研究認為Th17介導的免疫炎癥反應釋放大量炎癥因子逐步浸潤KC,而KC受刺激活化后產生的細胞因子可以吸引更多免疫效應細胞浸潤局部皮膚,使局部皮膚發生了一系列的病理改變的異常,從而導致銀屑病皮損形成。銀屑病皮損最早出現的病理改變為真皮微血管異常增生,在表皮異常增殖增厚、炎癥浸潤等典型病理改變之前,真皮乳頭層血管已經出現增生,迂曲擴張。因此血管新生與微循環異常在銀屑病發病機制中起到重要作用,而血管增生與 VEGF 密切相關[2,3]。研究表明,銀屑病患者VEGF的表達在皮損、血液中被強烈上調,證實其表達與PASI評分為正相關,血清VEGF濃度與銀屑病活動性之間的這種關聯,被認為是疾病嚴重程度的指標[4,5]。研究表明,抑制VEGF可以對銀屑病起到治療作用[6,7],現有臨床銀屑病相關的VEGF抑制劑主要包括VEGF單克隆抗體(貝伐單抗和蘭尼單抗等)、VEGFR2拮抗劑(融合蛋白Valpha等)、酪氨酸激酶抑制劑(舒尼替尼、索拉非尼等),在臨床治療中取得一定療效。中藥外用治療銀屑病常以清熱解毒藥物為主,本研究以內治之法指導外治之藥,結合局部皮損辨證,認為銀屑病局部病機特點為血熱毒蘊化瘀,并認為銀屑病遷延難愈與瘀熱互結密切相關,以涼血解毒通瘀理論指導銀屑病血熱證外用藥。清疕膏中藥物的有效化學成分,已經證實具有抗銀屑病的作用,具有一定理論基礎。例如:地榆中有效成分沒食子酸可顯著降低銀屑病標志物角蛋白16和角蛋白17的mRNA和蛋白表達,能明顯改善銀屑病發病面積和嚴重程度指數得分,降低銀屑病樣疾病小鼠的表皮增生[8]。牡丹皮有效成分丹皮酚[9]可能通過抑制VEGFR2/Akt/ERK 1/2信號通路和抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6的分泌,從而對銀屑病相關的血管異常新生和炎癥反應起治療作用。苦參有效成分氧化苦參堿具有抗炎及抑制某些細胞因子產生的作用,可作為一種免疫抑制劑,抑制AKs/STATs 信號通路激活,對銀屑病有很明確的治療作用[10]。故擬通過研究清疕膏對角質形成細胞增殖、分化,真皮血管增生的影響,以進一步了解清疕膏在銀屑病治療中的作用機制,并為清疕膏用于銀屑病的治療提供實驗基礎。

本實驗結果顯示給予IMQ誘導的銀屑病小鼠出現了鱗屑、紅斑等表現,在病理組織學上可見棘層肥厚、角化不全、角化亢進及角化不全區可見Munro微膿瘍等,說明通過IMQ誘導干預的銀屑病樣小鼠模型建立成功[11]。實驗期間,對模型組、清疕膏組及基質組小鼠的進行改良的銀屑病面積和嚴重程度評分,比較各組PASI評分,清疕膏組明顯低于模型組,對照組評分優于IMQ組,但改善程度不如清疕膏組。在實驗中還發現基質對照藥似乎有抗銀屑病的作用,這是由于其脂質性成分,凡士林可以減少皮損表面的鱗片,改善實驗動物模型中皮損表現。本實驗研究了清疕膏對VEGF的影響,清疕膏能夠明顯減輕皮損中VEGF蛋白及mRNA的表達,與模型組及對照組相比,差異有統計學意義。本研究發現清疕膏外用可能通過抑制KC細胞分泌VEGF,進而減少了小鼠銀屑病樣皮損中VEGF的表達,抑制真皮血管增生及KC的增殖、分化,而發揮了治療作用,從而清疕膏干預銀屑病的作用靶點。本研究探究涼血解毒通瘀理論指導中藥外用治療銀屑病的作用環節和效應靶點,初步證實該藥的作用機制,為銀屑病血熱證外用藥的治療及開發應用提供理論支持,為今后的進一步研究提供了證據與方向。