電針對CCH大鼠認知能力及海馬p-JAK2、p-STAT3水平的影響

程瑩瑩 艾琪 韓德雄 吳磊 劉婧 李璐

慢性腦灌注不足（Chronic cerebral hypoperfusion，CCH）長期低灌注使腦組織產生能量代謝異常、氧化應激、炎性細胞因子釋放、神經元凋亡［1］等病理變化，可導致認知力下降，是阿爾茨海默病（AD）、血管性癡呆（VD）和Binswanger病等疾病共同的病理基礎，其損傷機制尚不完全清楚，且不能闡述電針改善認知功能的確切機制。研究表明JAK2/STAT3磷酸化活化后與靶基因啟動子結合導致進一步的病理損傷，而去磷酸化失活后即能阻斷其異常表達，因此，本研究采用雙側頸總動脈結扎法（2-VO）構建CCH模型，采用電針干預，了解大鼠海馬組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，旨在研究電針對JAK2、STAT3磷酸化水平的作用，探討電針改善CCH認知能力的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源 從浙江中醫藥大學實驗動物中心購置健康清潔級雄性SD大鼠（3～4月齡）40只，體質量為（200±20）g，置于標準籠中飼養，自由進食飲水，溫度為18 ℃～22 ℃，相對濕度4%～50%，維持12 h/12 h的明暗周期。本研究通過浙江中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（No.ZSLL-2017-191）。

1.2 實驗方法 （1）造模與分組：造模前對所有大鼠進行局灶性腦血流（rCBF）檢測和Morris水迷宮測試逃避潛伏期評價。術前1 d，所有大鼠進行稱重，術前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛（40 mg/kg體質量）腹腔注射麻醉，采用2-VO法制備CCH模型，在37 ℃環境中大鼠完全蘇醒后，進行Morris水迷宮、rCBF檢測、分組或予以平衡處理。假手術組除了不行雙側頸總動脈結扎，其余操作同模型組。3只大鼠在造模過程中死亡，2只Morris水迷宮試驗中死亡，4只造模后逃避潛伏期無變化被剔除，根據計算機產生隨機數字，將造模成功過后的大鼠，隨機分為模型組（Model）、假電針組（Sham EA）、電針組（EA），每組各10只。假手術組（Sham）亦10只。（2）干預方法：EA組給予連續4周的電針干預，Sham EA除不進行電刺激外，其他操作同EA組。Sham組和Model組采取的抓取、固定、檢測、處死同EA組，不予針刺干預。EA組取穴：參照《實驗針灸學》［2］大鼠定位取穴，取“百會”、“大椎”穴電針：采用0.30 mm×25 mm無菌針灸針，百會穴沿頭部正中向后平刺約0.5 ㎝，大椎穴直刺約0.5 cm，兩穴不區分正負極接韓式穴位神經刺激儀，參數為2/15 Hz疏密波，電流為（2±1）mA，持續時間30 min，每天上午在實驗室治療1次，5次/周，周末休息。（3）腦組織取材：第28天完成Morris水迷宮和rCBF后，對每只大鼠進行稱重后以10%水合氯醛采用腹腔注射方式麻醉。每只大鼠經200 mL0.9%氯化鈉溶液快速灌注沖洗至肝臟發白，將大鼠斷頭置于冰臺快速分離取出新鮮海馬組織（分左、右兩部分）置于防凍管中，迅速置于液氮速凍，稍后移至-80 ℃冰箱保存。

1.3 評價指標 （1）局部腦血流檢測：采用PeriFlux 5000激光多普勒血流儀配合PROBE403 探頭檢測各組大鼠造模前（Pre-op）、造模成功后（Post-op）、術后1周、術后2周、術后4周大鼠局部腦血流（Regional cerebral blood flow，rCBF）。檢測點為大鼠右眼目外眥與外耳道孔連線的中點，消毒后，在兩點之間剪一約1 cm的橫向切口，鈍性分離局部皮下組織，暴露出骨平面，用棉球清理骨平面組織液；同時為防止腦血流檢測過程中不斷滲出的液體干擾，用棉球蘸取適量3%雙氧水清理骨表面。（2）Morris水迷宮行為學評價：通過Morris水迷宮評價大鼠的學習、記憶、認知、定向能力。大鼠造模成功后第23天開始評定，前5 d連續進行定位航行實驗測試，第6天進行空間探索試驗。定位航行試驗：大鼠造模后第23天開始，連續進行5 d，2次/d。軟件自動記錄大鼠逃避潛伏期。空間探索試驗：在定位航行試驗完成后（大鼠處死當天），撤出平臺，分別于4個入水點將大鼠放入水中，記錄60 s內大鼠在目標象限的停留時間。（3）Western Blot檢測海馬蛋白表達：海馬組織總蛋白的提取：提取步驟和方法嚴格按照說明書進行，完成后放置于-80℃冰箱保存。（4）蛋白濃度檢測：根據BCA法，嚴格按照操作規程準備蛋白質標準品，配制BCA工作液，用分光光度計獲得吸光值，繪制標準曲線，計算出樣品蛋白濃度。Western Blot：組織樣本提取完成后用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，并加入loading buffer進行蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%的分離膠進行電泳、轉膜、封閉。分別加入兔抗鼠GAPDH（1∶2,000）、SOCS3（1∶1,000）、JAK2（1∶1,000）、STAT3（1∶1,000）4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后，加入相對應二抗室溫孵育2 h，隨后ECL顯色。使用GE ImageQuant LAS4000凝膠成像儀掃膜并進行灰度值分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。Morris行為評價數據采用重復測量方差分析。組間比較方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett-t檢驗。同組干預前后用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組rCBF情況 各組大鼠術前rCBF差異均無統計學意義（P＞0.05）。造模成功后，與Sham組比較，Model組、Sham EA組和EA組大鼠不同時相rCBF均顯著下降（P＜0.01），且Model組、Sham EA組和EA組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。與同時相Sham組比較，Model組、Sham EA組、EA組大鼠的rCBF均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。與同時相Model組比較，Sham EA組在造模后2周、4周時均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），EA組在造模后1周、2周和4周時均升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與同時相Sham EA組比較，EA組在造模后2周和4周時均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組腦血流變化比較［（±s），PU］

表1 各組腦血流變化比較［（±s），PU］

注：與同時相Sham組比較，*P＜0.01；與同時相Model組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與同時相Sham EA組比較，△P＜0.05

組別只數缺血時間Pre-opPost-op1周2周4周Sham1098.21±2.0398.63±2.0198.02±2.0897.76±2.04100.07±2.10 Model1096.28±1.8935.48±1.29*49.83±2.51*61.59±1.65*71.31±2.19 Sham EA10103.32±2.1133.32±1.57*51.43±2.49*67.11±2.35*#76.79±2.05*#EA1099.92±1.9634.21±1.74*57.45±1.95*#72.97±1.35*▲△85.84±0.87*▲△

2.2 逃避潛伏期 第1天各組大鼠之間逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05）。與同時相Sham組比較，Model組大鼠潛伏期縮短緩慢，在第2天至第5天差異均有統計學意義（P＜0.01）；Sham EA組大鼠潛伏期縮短較快，在第2天至第5天差異均有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；EA組大鼠潛伏期縮短迅速，第2天和第3天差異有統計學意義（P＜0.05），在第4天和第5天時差異無統計學意義（P＞0.05）。與同時相Model組比較，Sham EA組大鼠和EA組大鼠潛伏期均縮短較快，在第3天開始至第5天差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與同時相Sham EA組比較，EA組大鼠在第4天和第5天差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組逃避潛伏期比較［（±s），s］

表2 各組逃避潛伏期比較［（±s），s］

注：與同時相Sham組比較，*P＜0.01，#P＜0.05；與同時相Model組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01；與同時相Sham EA組比較，○P＜0.05

組別只數時間第1天 第2天 第3天第4天第5天Sham1046.86±2.1425.79±2.6517.73±2.2514.7±1.7513.02±1.69 Model1052.1±2.3744.71±3.79*40.86±2.93*36.6±2.24*35.46±3.33*Sham EA1048.41±2.7237.59±3.66#30.6±3.85▲24.86±2.4*△24.95±2.08*△EA1047.23±2.0136.59±3.41#▲27.86±2.41#△17.28±2.76△○16.16±2.31△○

2.3 空間探索試驗 與Sham組比較，Model組大鼠和Sham EA組大鼠探索時間明顯縮短，差異具有統計學意義（P＜0.01），EA組大鼠探索時間差異無統計學意義（P＞0.05）。與Model組比較，Sham EA組大鼠和EA組大鼠探索時間均有增加，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與Sham EA組比較，EA組大鼠探索時間更長，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組空間探索60 s平臺象限停留時間比較［（±s），s］

表3 各組空間探索60 s平臺象限停留時間比較［（±s），s］

注：與Sham組比較，*P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與Sham EA組比較，ΔP＜0.05

組別只數平臺象限停留時間Sham組1021.26±1.46 Model組109.87±1.31*Sham EA組1014.47±1.39*#EA組1020.18±1.81▲Δ

2.4 各組大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平 見圖1-2。

圖1 各組p-JAK2表達水平。

圖2 各組p-STAT3表達水平。

3 討論

JAK/STAT是一條可被多種細胞因子調控的信號轉導通路，主要由酪氨酸激酶（JAK）家族、酪氨酸激酶相關受體、信號轉導子和轉錄激活子（STAT）家族組成［3］，在細胞的增殖、分化、凋亡、應激、免疫和代謝調節等過程中發揮著舉足輕重的作用，同時參與各種組織和器官缺血、缺氧和氧化應激［4］，是參與小膠質細胞活化調節的關鍵，抑制該通路的異常激活，可以減輕小膠質細胞的活化，抑制炎性因子釋放，減輕炎性損傷，從而發揮神經保護作用［5］。

在JAK/STAT通路的傳導過程中，先是受體各類細胞因子進行特異性結合，在細胞膜上形成二聚體，然后與JAKs結合位點結合，磷酸化進而活化，活化的JAKs進一步結合胞漿內STATs，使STATs磷酸化，磷酸化的STATs然后進入細胞核內，與DNA上的特定基因序列結合，調節轉錄，參與上述多種生理、病理過程［6］。慢性腦灌注不足后會釋放大量的炎性細胞因子如IL、TNF-α、γ-IFN，引起JAK2/STAT3通路異常激活。一方面，炎性因子與相應配體結合，促使膠質細胞中的JAK2、STAT3磷酸化，激活小膠質細胞，加重缺血、缺氧導致的神經損傷，同時在炎性因子的作用下，JAK2/STAT3信號轉導通路進一步上調，正反饋活化小膠質細胞，形成惡性循環［7］，不斷加重腦組織的慢性缺血、缺氧損傷，使認知障礙逐漸加劇。

本研究采用公認的2-VO法造模，結果顯示電針“百會”、“大椎”可提高CCH大鼠的rCBF，改善腦低灌注狀態，下調CCH后JAK2/STAT3的過度磷酸化水平提高學習記憶能力。隨著我國老齡化社會的不斷加劇，慢性腦灌注不足人群不斷增大，并且由于不良用頸習慣、飲食方式的影響，慢性腦低灌注甚至開始波及中青年，因此，本研究結果提示對于慢性腦低灌注人群進行針灸干預，能改善認知功能，提高認知障礙人群生活質量，減輕家庭和社會負擔。本研究主要著眼于電針對慢性腦低灌注海馬JAK2/STAT3的磷酸化水平的作用，現有研究顯示，JAK/STAT信號通路的負性調節因子包括3大類：活化STAT蛋白抑制因子（PIAS）、細胞因子信號轉導蛋白（SOCS）家族、蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）族［8］，下一步可以該通路的負性調節因子為切入點，研究電針對JAK2/STAT3及負性調節因子的效應，進一步闡釋電針改善認知功能的可能機制。