奶牛胚胎移植技術要點及應用前景

操禮軍，汪 暉，杜婷婷，劉 莉*，胡永青*

1 新疆畜牧科學院畜牧業質量標準研究所，新疆烏魯木齊 830000

2 新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

在畜牧業中，胚胎移植技術已成為動物學家和育種學家改善畜群遺傳，并迅速增加優良畜種的有力工具，目前已廣泛應用在遺傳改良、種畜繁育和保種、疾病控制、基因工程研究等方面。具體到牛上，胚胎移植技術是指將一頭良種母牛配種后的早期胚胎取出，移植到另外一頭或數頭同種的、生理狀況相同或相似的母牛生殖道的適當部位，使之繼續發育成新個體的過程。該方法提升了遺傳改良并縮短了世代間隔，是一種提高繁殖力的有效方法[1]。

牛胚胎移植技術涉及供體和受體動物的選擇和管理，以及胚胎的收集和移植。在牛中使用胚胎移植的主要目標是提高有價值的雌性的繁殖率。因此，有價值的雌性的后代數量增加到至少比正常情況下高出5 倍的水平。胚胎移植被描述為將從供體動物的生殖道中獲得的胚胎或在實驗室條件下在體外產生的胚胎移植給一個或多個同步受體。體內胚胎生產的階段包括供體動物和受體動物的選擇，所選供體和受體的發情周期的同步，誘導超排卵和隨后的供體授精，收集，胚胎的評估和移植。

1 胚胎移植技術的發展

歷史上第一次哺乳動物胚胎移植的案例發生在1890年，Walter Heape將安哥拉兔胚胎移植到比利時兔輸卵管中，并順利產下了6 只幼兔[2]。1934年Warwick等[3]又報道了第一例山羊胚胎移植。后來學者又在牛等動物上進行了相關研究。

現代的胚胎移植技術是在20 世紀70 年代發展起來的，Wilmut 和Rowsond 等[4]成 功 地 實現了牛胚胎的低溫保存。在過去的3 0 年里，胚胎移植技術的發展經歷了3 個階段的變化：第一代是通過超數排卵、非手術恢復和移植從供體獲得胚胎。第二代是通過卵子的體外受精獲得體外胚胎。第三代是進一步發展了體外受精技術，創新了胚胎微操作技術，涉及體細胞和胚胎干細胞的克隆、著床前遺傳學診斷、轉基因動物生產等內容。

2 胚胎移植技術的原理及過程

胚胎移植技術的原理是通過收集基因優良的雌性的胚胎，并將收獲的胚胎移植到受體動物體內，從而增加優良雌性動物的子代數量和遺傳基因優勢。利用胚胎移植技術可以提高奶牛的繁殖率，通過更高的選擇強度、更短的世代間隔和更多的雌性后代來傳遞理想性狀。

目前的牛胚胎移植技術通常包括供受體的選擇、供體動物的發情同步和超數排卵、供體動物的授精、從供體收集胚胎、轉移到受體（新鮮）或冷凍保存、胚胎體外培養、胚胎分割、胚胎檢查和性別鑒定、胚胎移植等步驟。

2.1 供體選擇

胚胎的數量與質量由供體的選擇決定，囊胚期前的胚胎發育主要靠母系遺傳物質來維持，只有當受精卵運用自己的基因組而不再是母系遺傳物質時才能夠進入囊胚發育期階段。胚胎移植的第一步是選擇供體牛，選擇遺傳或表型優良的動物是供體選擇的基礎，供體奶牛必須具備遺傳優勢，能夠產生大量可用胚胎的特性[5]；具有規律的發情期，每次受孕不超過2 次，沒有分娩困難，沒有可檢測到的遺傳缺陷[6]；同時供體的營養水平應與體型和產奶量相適應，體況評分良好。此外良好的公牛或者凍精是至關重要的，在后裔測定中應具有優異的性狀表現，并且營養狀況良好。

2.2 超數排卵

超數排卵是指在一個發情期釋放許多卵母細胞的方法。在牛中，有兩種普遍接受的超數排卵方法。一種方法是在發情周期的第10天肌內注射（IM）1 次2 000～2 500 IU的馬絨毛膜促性腺激素（eCG），然后在2 天或3 天后間隔12～24 h注射2 次前列腺素。另一種方法是使用促卵泡激素（FSH）。在正常的發情周期中期或接近尾聲時，在卵巢上會出現功能性黃體（CL），每天注射2 次FSH，連續4 天；在胚胎移植計劃的第3天注射PG，這將導致CL消退，48～60 h后出現發熱或發情；在這時，牛通常會產生7～20 個或更多的存活卵子[7]。由于卵子數量增加，因此比正常情況下更需要確定存活的精子細胞來授精，所以至少相隔12 h用2 支精液，7 天后沖洗子宮以收集胚胎。

2.3 胚胎收集

目前比較普遍的是非手術方法采集牛胚胎，該方法通常要使用雙向流動導管，用大量的商品化的沖洗液（500～2 000 mL）來沖洗子宮，然后將液體從子宮返回，經不銹鋼或尼龍篩將胚胎封入塑料杯中。當胚胎被識別后，要立即被轉移到含有新鮮無菌培養基中。通常使用含有青霉素和10%～20%熱滅活血清的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）作為保存介質。然后通過至少3 個不同的裝有新鮮無菌培養基的培養皿連續沖洗，每一步都需要新的無菌移液管。最后將它們收集后，利用立體顯微鏡評估胚胎形狀、顏色、質地和大小等因素，篩選出質量良好的胚胎待轉移或冷凍保存[8]。

2.4 胚胎凍存

胚胎凍存通常采用甘油作為低溫保護劑。甘油在冷凍過程中保護了胚胎，但如果在移植前不移除，對胚胎是致命的。一旦胚胎被冷凍，解凍程序需要3～4個步驟的沖洗，以去除甘油，然后再轉移。這個過程可能需要15～20 min。在乙二醇中冷凍胚胎用于解凍后直接移植的方法已被廣泛采用[9]，這使得在野外條件下解凍胚胎的移植更加實用。冷凍胚胎的解凍方式與冷凍精液非常相似，應在嚴格控制時間和溫度的條件下處理。

2.5 同期發情

胚胎移植的妊娠率部分取決于受者與胚胎供者在24 h內發情時間的同步性。通過檢測未處理動物的自然發情或通過藥物誘導的同步發情后，可以選擇受體動物進行胚胎移植計劃。因為前列腺素（PGF）誘導的受者發情會在60～72 h發生，而超數排卵的受者發情會在3 6 ～4 8 h 發生，受體牛只必須在供體牛只前12～24 h接受治療，以保證其發情周期趨于一致，特別是鮮胚移植，其差異不得超過12 h[10]。目前牛的同期發情主要采用一次PG法、二次PG法與陰道孕酮栓（CIDR）+PG法，不同處理方法效果差異不大，且技術路線十分成熟。

2.6 胚胎移植

胚胎移植分為手術和非手術兩種方法。在大多數情況下，非手術轉移是首選方式。目前使用的非手術胚胎移植包括人工授精移液管和胚胎移植移液管的使用。發情同步確認后，移植前，進行第二尾間隙硬膜外腔麻醉，去除直腸的糞便，消毒外陰部。移植過程是將凍存胚胎在水浴中解凍，然后用蔗糖將胚胎復蘇，并重新裝入0.25 mL吸管，胚胎間至少間隔2 個氣泡，然后將吸管裝入胚胎移植移液管中。全程必須小心確保吸管與移植槍外套緊密接合，以避免泄漏。胚胎通過移液器穿過子宮頸，被放置在毗鄰CL的卵巢的子宮角中，非常類似于人工授精[12]。

3 胚胎移植技術在奶牛生產中的應用

如今胚胎移植技術已經發展成較成熟的產業，利用胚胎移植技術可以加強遺傳選擇、診斷和治療不孕不育的、控制疾病傳播、篩選基因缺陷的牛只、繁殖稀有和瀕危物種，以及進行發育生物學等方面的研究。

3.1 遺傳改良

胚胎移植技術現在被用于遺傳改良，特別是在奶牛養殖業，今天使用的大多數精液來自通過胚胎移植生產的公牛。超數排卵和胚胎移植技術被用來增加遺傳優秀的雌性和優秀的父系后代的數量。并且隨著選擇強度的增加和世代間隔的縮短，選擇為胚胎移植的雌性，可以在群體內獲得遺傳增益。此外，新的基因組技術正越來越多的應用于選擇胚胎供體，基因組分析也已成為選擇胚胎移植的牛只的必要條件。

3.2 疾病控制

胚胎移植技術可用于控制基因疾病的大規模傳播。首先胚胎移植技術通過有效的篩選供體雌性和雄性牛只，就可以在初步階段篩選掉一些具有疾病的牛只。并且胚胎可以進行活檢和染色體組型分析，進一步對染色體組型異常的個體進行鑒別和淘汰。此外通過檢查透明帶、胰蛋白酶處理，以及清洗等程序，使體內衍生的胚胎可以去除特定的病原體。因此，一些研究者建議在疾病暴發時可以利用胚胎移植技術挽救遺傳群體[13]，同時也可以作為建立無病畜群的有效替代方法。

3.3 種畜保護

對于單胎動物而言，要獲得純種的后代，至少需要7～8 個世代的繁殖，要經歷15～20 年的時間。而采用胚胎移植技術以純種母畜為供體，通過超數排卵和人工授精技術，經過一代就可獲得純種后代[14]，可以大大縮短繁殖時間。因此在保護動物遺傳資源、繁衍瀕臨滅絕的野生動物等方面，胚胎移植技術也發揮了重要的作用。

3.4 發展生物技術

當前許多生物工程研究必須借助胚胎移植技術的基礎來實現，因此也催生了結合胚胎移植等生物技術的相關研究。比如通過胚胎移植技術檢測奶牛和公牛中不良隱性性狀的攜帶者；對于某些特征，如并指畸形和侏儒癥，缺乏純合子的、可生育的雌性作為疑似攜帶者公牛的配偶，通過胚胎移植技術擴大生產，從而測試公牛是否為攜帶者。有了超排卵和胚胎移植，1～2 個療程的超排卵將提供足夠的胚胎來測試大多數奶牛；此外，接受者可以是雙胞胎，在懷孕2 個月左右對胎兒進行檢查，以診斷出許多這些缺陷。因此，通過胚胎移植，可以快速解決原本難以解決的問題[15]。

4 胚胎移植電子數據的建立

胚胎移植電子數據的建立對奶牛場開展胚胎移植管理具有重要意義，目前，粗放式管理對奶牛的生產性能、繁殖性能、譜系及后裔信息等記錄不全，不利于奶牛胚胎移植數據系統管理，造成奶牛場生產水平低下。而奶牛胚胎移植電子數據的建立可基于受體母牛電子耳標，配備自動識讀器，通過無線網絡、智能化技術裝備、可視裝備、信息編碼、電子數據交換等技術對受體母牛的基本信息、移植胚胎來源基本信息及移植過程信息進行系統采集和管理。

對實施胚胎移植的奶牛場奶牛存欄量、品種、受體母牛及胚胎移植相關材料信息通過大數據實現自動獲取，用以支持胚胎移植過程管理。通過數據模塊對奶牛胚胎移植、奶牛群體檔案進行記錄和存儲，包括基本檔案，所有奶牛的血統資料，以及奶牛的繁殖性能測定、體形外貌評分、繁殖遺傳力評估結果等方面的資料，這些資料對于奶牛繁殖、生產管理與飼養等方面的工作具有重要的價值。另外，制定出一個與新疆奶牛場自身相適應的繁殖循環標準，在奶牛繁殖過程中，預先提醒繁殖過程中奶牛要發生的繁殖事件，在繁殖過程中出現意外狀況，就要重新進行運算和提醒。奶牛繁殖評價先要統計所有奶牛的資料，只有資料完整時，才能做出完整、準確的評價，可根據奶牛場的現有實際情況，還有奶牛場的發展需要，分析牛群特征，然后在奶牛繁殖評價模塊中根據繁殖指標，作出全面的繁殖評價結論，確定牛群繁殖現有狀況和發展方向，改進奶牛胚胎移植的方法。

5 胚胎移植技術前景

通過胚胎移植技術可以提高良種公畜的配種效率，充分挖掘優良母畜的繁殖能力。胚胎移植技術還被應用在肉牛雙胎的生產中[16]，提高生產效率。加快優良品種繁育，品種資源保存等優點，使得胚胎移植技術在國內外的科研和商業生產中得到廣泛應用。

胚胎移植技術在家畜育種上可充分發揮優良母畜在品種改良和育種中的作用，尤其是對于牛、羊等單胎家畜來說，可以通過超數排卵和胚胎移植技術使得供體繁殖后代增加7～8 倍。并從更多的頭數中加大選擇強度，利用更多的親緣個體群的記錄從而提高選擇準確性；可以增加后代的數量，縮短世代間隔。在特定品種擴繁上，對于牛、羊等單胎動物，通常獲得某一品種的純種一般需要經過7～8 個世代，要15～20年的時間。而采用胚胎移植的方法，可以選擇純種母畜為供體，通過超數排卵和人工授精技術，一次就可獲得純種后代。20世紀80年代后期，隨著我國牛羊胚胎移植技術水平的提高，一些省市先后在中國荷斯坦牛、西門塔爾牛、安哥拉山羊、優質細毛羊的擴繁上應用該項技術，使這些優良品種的后代數量大大增加，為提高我國牛羊品種的整體水平起到了積極的作用。

在保護動物遺傳資源、提高家畜生產性能、挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術已經越來越發揮出重要的作用。在偶蹄目和靈長目等動物上，國外通過手術方法和經子宮頸的非手術方法移植胚胎獲得了后代。當前國外已開始建立生殖細胞保存中心，即冷凍動物園。通過體外受精技術、冷凍精液的人工授精技術，將冷凍胚胎移植給亞種等來獲得后代的胚胎移植技術，不僅大量保存了珍貴的遺傳資源，而且也為珍稀動物的繁衍和國際交流創造了新的機遇。

目前我國胚胎移植技術正在快速發展，更多地應用到畜牧生產領域中，同時也促進了其他需要在體外操縱卵母細胞或胚胎的技術的開發，如試管受精、胚胎分割、性別鑒定[17]、基因動物的生產、基因編輯[18]以及核移植克隆[19]等技術。相信隨著與之相關的一些研究進一步加深，胚胎移植將發揮出更加廣闊的前景。