基于廣泛靶向代謝組學的2 種百香果風味差異研究*

袁啟鳳，顏培玲，史斌斌，陳 楠，王立娟，盧 晨，李仕品

（貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴陽 550006）

百香果學名西番蓮（PassifloraedulisSims.）[1]，目前主要在貴州省低海拔、熱量豐富的縣區發展，如羅甸、貞豐、從江、榕江等地區。百香果屬于“短、平、快”產業，作為“當年種植當年見效”的樹種，百香果也從零星種植發展到大面積種植，品種也從以紫果為主的品種發展為黃果等多品種共存的格局，逐步滿足了消費者對不同風味的需求。紫果類品種以臺農一號為代表，黃果類品種以芭樂味黃金百香果為代表。除貴州省外，福建、廣西、云南、海南等省區市也是我國百香果的主產地[2-3]。但不同地區的百香果種植環境、種植模式有所不同，也可能導致同一品種在風味上存在一定的差異。果實風味不但關系到消費者味覺的感受，而且還關系到果品本身的營養價值[4]。百香果富含蔗糖、黃酮、氨基酸、有機酸、維生素等營養物質[5-6]，紫果類品種果實成熟時果皮呈現紫紅色，香氣濃郁，但口感酸，鮮食率低，黃果類品種果實成熟時果皮為金黃色，酸度低，糖度高，口感為純甜味，鮮食率高，但香味相比紫果類品種淡[7-8]。

廣泛靶向代謝組學分析是一種結合非靶向代謝組學和靶向代謝組學優點的新方法，利用基于多反應監測模式的QTRAP 質譜法，可同時定量數百個已知代謝物和近千種未知代謝物，實現了高靈敏度、廣泛靶向代謝物的檢測和鑒定[9]。為探明貴州產區紫果類和黃果類百香果風味上的差異，本文基于超高效液相色譜-串聯質譜廣泛靶向代謝組學的方法對2 種百香果內含物質的代謝物種類及相對含量進行檢測，以期找出差異代謝物，并從差異代謝物角度揭示2 種百香果風味差異的原因，為深入研究百香果風味形成機理及定向育種提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為紫果百香果（臺農一號）和黃金百香果（芭樂味黃金百香果）。紫果百香果成熟時果皮為紫紅色，果形為橢圓形，口感酸甜，香氣濃郁；黃金百香果成熟時果皮為金黃色，果形為扁圓形至圓形，口感純甜，香味偏淡。2 個品種果實采集于貴州省安順市鎮寧縣良田鎮壩草村貴州省農業科學院果樹科學研究所亞熱帶果樹示范基地，均在果實成熟期挑選大小、色澤、成熟度一致且無機械損傷的果實，運回實驗室進行處理。

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜（UPLC，Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A）、串聯質譜（MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP）、甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck）、乙醇（色譜純，Merck）、標準品（色譜純，BioBioPha/Sigma-Aldrich）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本的采集及制備

以紫果百香果和黃金百香果果汁為試材，分為A、B 2 個組進行代謝組分析，每組設3 個重復。將樣品分別置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg 粉末溶解于0.6 mL 的70%甲醇提取液中，溶解后的樣品置于4 ℃冰箱中過夜，其間渦旋6 次以提高提取率，10 000 r/min 下離心10 min，取上清，微孔濾膜（0.22μm pore size）過濾樣品，保存于進樣瓶中用于超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS 數據采集條件

液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1 mm×100 mm；流動相中A為超純水（含0.04%乙酸），B 為乙腈（含0.04%乙酸）；洗脫梯度為0～10 min，5%～95%B，10～11 min，95%B，11.0～11.1 min，5%B，11.1～14.0 min，5%B；流速條件0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量4μL。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣（CUR）30 psi，碰撞誘導電離（CAD）參數設置為高。在三重四級桿（QQQ）中，根據優化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）對每個離子對進行掃描檢測。

1.4 數據分析

混樣質控樣本（QC）mix01、mix02、mix03 由A 組和B 組百香果混合而成，用于判斷代謝物提取和檢測的重復性。代謝物定性基于武漢邁維生物技術有限公司自建數據庫MWDB（metware database）、代謝物信息公共數據庫和二級譜信息完成。運用Analyst 1.6.3 軟件處理質譜數據。根據代謝物保留時間與峰型信息，對每個代謝物在不同樣本中檢測到的質譜峰進行校正，以確保定性定量的準確。將代謝物數據進行無監督的主成分分析（PCA）和有監督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）以觀察分組之間和組內樣本之間的變異度大小。根據獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影VIP 值和差異倍數值（Fold Change，FC）進一步篩選差異代謝物。相對含量采用峰面積歸一法進行計算，利用SPSS 22.0 軟件分析差異顯著性。將差異代謝物映射到KEGG 數據庫中進行注釋，根據注釋結果按照KEGG 通路中的類型進行分類。

2 結果與分析

2.1 百香果廣泛靶向代謝組學分析

如表1 所示，紫果百香果和黃金百香果中共檢測到代謝產物11 類405 種，包括黃酮類103 種、酚酸類49 種、氨基酸及其衍生物66 種、核苷酸及其衍生物35 種、有機酸31 種、生物堿20 種、糖及醇類21 種、木脂素和香豆素11 種、脂質48 種、維生素8 種、其他13 種；2 種百香果果實檢測到共有代謝物、差異顯著代謝物分別為366 種和263 種，共有代謝物黃酮類81 種、酚酸類43 種、氨基酸及其衍生物64 種、核苷酸及其衍生物35 種、有機酸29種、生物堿17 種、糖及醇類21 種、木脂素和香豆素10 種、脂質47 種、維生素7 種、其他12 種。紫果百香果代謝產物有383 種，未檢測到的黃酮類主要是槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合歡素、芹菜素、矢車菊素等11 種糖苷衍生物，酚酸類是異綠原酸B、3-（4-羥基苯基）丙酸、肉桂酸乙酯等3 種，氨基酸及其衍生物是N-（3-吲哚乙酰基）-L-丙氨酸1 種，有機酸是α-羥基異丁酸、3-羥基丁酸等2種，生物堿是N-芥子酰腐胺、N′-阿魏酰腐胺、N-阿魏酰基胍丁胺等3 種，脂質是甘油亞油酸酯1 種，其他是Z-蒿本內酯1 種；黃金百香果代謝產物有388 種，未檢測到的黃酮類主要是山奈酚、刺槐素、新奧司明、香葉木素、木犀草苷、香葉木苷、金圣草黃素、圣草次苷等11 種，酚酸類是香蘭素、1-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸等3 種，氨基酸及其衍生物是順式-4-羥基-D-脯氨酸1 種，木脂素和香豆素是東莨菪內酯1 種，維生素是煙酸1 種。本次檢測結果發現，2 種百香果雖各自具有一些獨特的物質，但主要還是集中體現在黃酮類和酚酸類物質上。

表1 2 種百香果代謝產物數量統計

2.2 主成分分析及聚類分析

將2 種百香果總共405 種代謝產物進行主成分分析，第1 主成分解釋了總方差的62.54%，第2 主成分解釋了總方差的14.21%，其中3 個紫果百香果樣品、3 個黃金百香果樣品和3 個質控樣品分別獨立聚在一起（圖版4-A-a）。利用歸一化方法UV（unit variance scaling）對代謝產物含量數據進行處理，使用R 軟件分析并形成熱圖，聚類分析代謝物在不同樣本間的積累模式如圖版4-A-b，結果顯示，紫果百香果和黃金百香果代謝產物分別具有相似的積累趨勢。主成分分析和層次聚類分析均表明，紫果百香果和黃金百香果之間具有不同的代謝產物特征，這為后續分析差異代謝物提供了基礎。

2.3 差異代謝物的篩選與分析

基于OPLS-DA 結果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影VIP 值（VIP≥1）和代謝物含量的差異倍數值（FC≥2、FC≤0.5），如圖版4-B 所示，2 種百香果篩選到的差異代謝物有163 種（上調80 種、下調83 種）。由表2 可知，紫果百香果和黃金百香果共篩選到11類163種差異代謝物，其中黃酮類72 種（上調31 種、下調41種）、酚酸類28 種（上調15 種、下調13 種）、氨基酸及其衍生物15 種（上調3 種、下調12 種）、核苷酸及其衍生物9 種（上調4 種、下調5 種）、有機酸9 種（上調7 種、下調2 種）、糖及醇類5種（上調4 種、下調1 種）、維生素3 種（上調2種、下調1 種）、脂質6 種（上調5 種、下調1 種）、生物堿8 種（上調5 種、下調3 種）、木脂素和香豆素3 種（上調0 種、下調3 種）、其他5 種（上調4 種、下調1 種）。從數量上看，黃酮類和酚酸類都構成了2 種百香果的主要差異代謝物，與紫果百香果相比，黃金百香果中下調物質多于上調物質。

表2 2 種百香果果實差異代謝物統計

將檢測到的代謝產物進行定性分析和定量分析，比較代謝產物定量信息在各分組中發生的差異倍數變化，將差異代謝物的差異倍數進行log2 處理，即將FC 值進行log2 轉換之后，FC 值被劃分成正、負，可以直觀地通過正、負來判斷上調、下調，然后根據log2FC 絕對值的大小判斷差異強度。若FC原值不進行轉換，則結果全是正值，無法直觀判斷上調還是下調。從表3 可以看出，與紫果百香果相比，黃金百香果變化程度（log2FC）排在前10 位的上調代謝物包括5 種酚酸類、3 種有機酸、1 種黃酮類和1 種生物堿，下調代謝物包括9 種黃酮類和1種酚酸類。從前10 位差異代謝物來看，黃酮類、酚酸類和有機酸構成了2 種百香果的主要差異代謝物質。

表3 2 種百香果差異倍數排在前10 位的代謝產物

差異倍數排在前10 位的上調代謝物包括了3種有機酸，這一現象與黃金百香果實際口感不一致，比較2 種百香果中糖、酸、氨基酸的差異情況（表4）可以發現，黃金百香果中除磷酸葡糖酸下調外，其余4 種糖均上調；而峰面積最大的L-高絲氨酸下調。雖然黃金百香果中上調有機酸種類遠遠高于下調，但果實中酸甜風味主要取決于糖和酸之間總量平衡關系。此外，呈味氨基酸在果實風味中也發揮比較重要的作用，紫果百香果和黃金百香果中13種氨基酸相對含量差異顯著，紫果百香果中11 種氨基酸及其衍生物上調、2 種下調，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 種呈味氨基酸顯著高于黃金百香果。

表4 2 種百香果中主要的糖、酸和氨基酸代謝差異統計

2.4 差異代謝物KEGG 富集分析

將差異代謝物進行KEGG 富集分析，其中代謝物富集較多且差異顯著的通路包括黃酮和黃酮醇類生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）、黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、哌啶和嘧啶生物堿合成（Tropane piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）、煙酸和煙酰胺代謝（Nicotinate and nicotinamide metabolism）以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）等（圖版4-C）。KEGG 富集分析同樣顯示，黃酮相關的通路是2 種百香果差異最顯著的。

3 討論與結論

2 種百香果共含有黃酮類、酚酸類、氨基酸類、有機酸類、糖及醇類等405 種代謝產物，其中功能性物質黃酮類、酚酸類種類最多，也是紫果百香果和黃金百香果中差異代謝物數量最多的兩類物質，同時2 種百香果各自獨有的黃酮類物質也是最多的。百香果作為民間傳統藥用植物，廣泛應用于利尿、止咳、消炎止痛[10-11]。通過差異代謝物篩選，共得到163 種物質，同樣以黃酮類（72 種）、酚酸類（28 種）為主。KEGG 富集分析顯示，黃酮相關的通路也是2 種百香果差異最顯著的。黃酮和酚酸功能復雜，在調節果實風味方面具有很重要的作用，此外，在提高植物抗逆性、影響果實色澤方面也發揮著重要的作用[12-14]。柿、葡萄和核桃內種皮因富含單寧、兒茶素等而具有澀味[15-17]，柚子有明顯的苦味是因為富含柚皮苷[18]，新橙皮苷也是柑橘的苦味來源[19-20]。百香果中檢測到一定量的新橙皮苷、原兒茶酸，但吃的時候察覺不到苦澀味很可能是被別的物質中和，所以黃酮類和酚酸類物質是如何影響百香果風味的，還需進一步研究。

水果中的糖和有機酸組分及比例是影響果實風味的重要因素[7,21]。百香果果汁中含有豐富的糖和有機酸，2 種百香果中共檢測到山梨糖醇、葡萄糖等21 種糖醇以及檸檬酸、琥珀酸等31 種有機酸，其中5 種糖和9 種酸相對含量差異顯著。黃金百香果中磷酸葡糖酸下調，耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸上調；L-高絲氨酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸下調，（S）-2-羥基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、5-羥基己酸、2-羥基丁酸、半乳糖醛酸上調；α-羥基異丁酸、3-羥基丁酸獨有。雖然黃金百香果中上調代謝物的數量遠遠高于下調代謝物，但黃金百香果總酸含量低于紫果百香果[22]，所以黃金百香果中上調和獨有的7 種酸很可能對總酸的貢獻量不大，L-高絲氨酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸2 種酸的下調才是造成黃金百香果總酸含量低于紫果百香果的主要原因。同理，黃金百香果口感甜于紫果百香果，是因為糖含量高，與耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸4 種糖上調有關[22-23]。氨基酸不僅是食物中重要的營養成分，同時在豐富食物味道方面也起到重要的作用[24-25]，一般意義上把谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6 種能呈現出特殊鮮味的氨基酸稱為呈味氨基酸。百香果中氨基酸含量豐富，檢測到66 種氨基酸及其衍生物，紫果百香果和黃金百香果中15 種氨基酸及其衍生物相對含量差異顯著，紫果百香果中12 種氨基酸及其衍生物上調，3 種下調，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 種呈味氨基酸顯著高于黃金百香果，L-天冬氨酸和苯丙氨酸在食品加工過程中通常作為香味劑、鮮味劑添加使用，因此以苯丙氨酸、L-天冬氨酸為代表的氨基酸的上調是導致紫果百香果香味、鮮味濃于黃金百香果的重要原因[23]。

百香果因其獨特香氣而備受歡迎，主要是因為含有豐富的芳香類物質[26]。脂質是芳香類物質等揮發性有機物的前體物質，在百香果成熟過程中顯著降低[27]。紫果百香果和黃金百香果中6 種脂質含量存在顯著差異，紫果百香果中5 種脂質上調、1 種下調，紫果百香果香味更加濃郁很可能與單酰甘油酯、甘油亞油酸酯等5 種脂質的分解上調密切相關。