靈芝高活力液體菌種培養條件的優化

和耀威,張 林,向 準,李 鵬

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.貴州高山六芝園種植有限公司，貴州 貴陽 550014)

靈芝具有很高的藥用價值，對提升免疫力、改善心血管系統和防治高血壓等具有較好的作用[1]，市場前景廣闊。傳統的固體食用菌菌種生產相比液體菌種過程復雜，流程繁瑣，生產周期長且成本高昂，菌種活力不均一，菌種上部易出現老化現象[2]，制約靈芝產業規模化集約化發展。液體菌種的生產是在發酵罐內進行，菌體細胞處于最適的溫度、酸堿度、氧氣、碳氮比等條件下，以動態方式培養，具有生產周期短、菌種純度高活力強、接種方便、滿袋（瓶）時間短、成品率高等優點，是食藥用菌規模化和機械化生產的發展趨勢。為縮短菌種生產周期和提高菌種活力，以液體菌種碳氮源篩選獲得的結果為基礎（一級液體種培養基配方為每升中含葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH 自然），選用優化配方［二級液體種基質配方為每升中含葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，消泡劑（豆油）0.05%，pH 自然］作為發酵罐液體種的基礎配方，通過測定不同對發酵液pH、培養溫度、接種量、培養時間條件下的菌絲生物量，探究優化二級液體菌種的培養條件及生產工藝，以期為靈芝液體菌種的推廣和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株選用南GL11，由國家菌草工程中心提供的福建省審定品種。

1.2 培養基配方

1.2.1 PDA 培養基 馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，水1 000 mL。

1.2.2 搖瓶培養基配方(1 L) 葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白 胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g。

1.2.3 發酵罐液體菌種培養基 葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，豆 油0.05%，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 搖瓶菌種和發酵罐培養基的制作

1）搖瓶菌種的制作。每個三角瓶裝培養基500 mL，并加入少量玻璃珠，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后在超凈工作臺中接種經過活化的母種菌塊10 塊。在培養箱內28 ℃黑暗靜置2 d，肉眼可見菌塊萌發后內置于搖床26 ℃培養4～5 d，轉速為120～140 r/min。當搖瓶菌種培養好后，在超凈工作臺酒精燈火焰旁，按照無菌操作將液體菌種收集于已滅菌干燥的大三角瓶內，用于后續接種。

2）發酵罐培養基的制作。首先對空氣過濾器進行單獨滅菌，滅菌條件為121 ℃維持30 min，并調整空氣閥大小，將空氣過濾器吹干。然后進行發酵罐空消，將夾套中的水排干凈后，進行121 ℃高溫滅菌30 min。滅菌后待溫度降至80 ℃以下，排干凈管內冷凝水。最后將培養料投入發酵罐內，每個發酵罐裝培養基40 L，高壓滅菌30 min，冷卻至25 ℃時接入搖瓶菌種1 500 mL，通入經過過濾的空氣，培養5～7 d。

1.3.2 發酵罐菌種培養條件的優化

1）發酵液培養溫度試驗。試驗溫度24～32 ℃，共設置5 個溫度處理，分別為24 ℃、26℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃。起始pH 6.0，發酵罐每罐裝液量均為40 L，培養時間均為7 d。培養過程中觀察并記錄每個處理的菌絲體或菌絲球的生長情況，并統計每個處理的菌絲生物量。

2）發酵液起始pH 試驗。以液體培養基為基礎，試驗pH 5～7，共設置5 個梯度處理，pH 分別為4、5、6、7、8。培養溫度26 ℃，發酵罐每罐裝液量均為40 L，培養時間均為7 d。觀察并統計菌絲生物量。

3）發酵液接種量試驗。選用容積為60 L的液體發酵罐，發酵罐每罐裝液量均40 L；接種量1%～10%，共設置6 個處理，依次是接種量為1%、2%、4%、6%、8%、10%。培養基的起始pH 均調節至6.0，培養溫度26 ℃，培養時間均為7 d。觀察并統計菌絲生物量。

4）發酵液培養時間試驗 發酵液培養時間范圍4～8 d，共設置5 個時間處理，依次為培養4 d、5 d、6 d、7 d、8 d。發酵罐每罐裝液量均40 L，培養基的起始pH均調節至6.0，培養溫度26 ℃。觀察并統計菌絲生物量。

1.3.3 菌絲生物量測定 各處理培養液混勻后取100 mL 發酵液，分裝于兩個50 mL 離心管內，置于離心機內，進行5 000 r/min 離心，時間為10 min。然后放入烘箱，50 ℃條件下烘干菌絲至恒重，測定各處理菌絲生物量干重。

1.4 數據統計與分析

所有試驗數據均用SPSS Statistics 17進行統計分析（P＜0.05），用origin 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵液培養溫度靈芝的菌絲生物量

從圖1 可知，不同培養溫度處理下，靈芝菌絲生物量具有顯著性差異。其中培養溫度為28 ℃時，菌絲生物量最重，達132.18 mg/100mL，培養溫度為26 ℃時，菌絲生物量略有下降，為128.16 mg/100mL，但與28 ℃處理間無顯著性差異。當培養溫度較低，為24 ℃時，靈芝菌絲體生物量最少，為90.12 mg/100mL。溫度從24～28 ℃變化時，菌絲生物量隨溫度的增加而增加；靈芝雖為高溫菌，但當溫度增加到32 ℃時，菌絲生物量降低，不適合菌絲體的生長與擴繁。因此靈芝發酵液的最適培養溫度為26～28 ℃。

圖1 不同發酵液培養溫度靈芝的菌絲生物量

2.2 不同發酵液起始pH靈芝的菌絲生物量

從圖2 可知，培養液pH 4～8 時，靈芝菌絲體均能生長，當發酵罐液體菌種的培養液起始pH 增加時，菌絲生物量出現先增后減的規律。pH 6 處理的菌絲生物量最大，為121.52 mg/100mL，并顯著高于其余處理。菌絲生物量依次是pH 6 處理＞pH 5 處理＞pH 7處理＞pH 8＞處理＞pH 4處理。因此，靈芝最適pH為6，為偏酸性高溫木腐菌。

圖2 不同發酵液起始pH靈芝的菌絲生物量

2.3 不同發酵液接種量靈芝的菌絲生物量

從圖3可知，不同接種量處理的菌絲生物量差異顯著。其中接種量1%的生物量最低，菌種量過少，不利于短時間內獲得足夠菌絲量；接種量從1%增加到4%時，菌絲生物量從40.00 mg/100mL 急劇增加到132.00 mg/100mL。接種量增加到6%時，菌絲生物量比4%接種量相比略有降低，為128.43 mg/100mL，但兩者間無顯著差異；接種量達10%時，菌絲生物量下降至82.65 mg/100mL。接種量過低，萌發點少，菌絲生物量低；接種量過多，菌絲亦衰老自溶，菌絲生物量亦會降低。因此接種量以4%～6%為宜。

圖3 不同發酵液接種量靈芝的菌絲生物量

2.4 不同發酵液培養時間靈芝的菌絲生物量

從圖4 可知，4～6 d 處于對數生長期，菌絲生物量增加顯著，6 d 時最高為123.60 mg/100mL，7 d 時菌絲生物量較6 d稍有下降，8 d 時菌絲生物量較6 d 顯著降低，可能是由于6～7 d 時靈芝菌絲處于穩定生長期，菌絲生長量與消亡量處于動態平衡，生長狀態基本趨于穩定。而從8 d 開始菌絲體進入衰亡期，菌絲量減少顯著。因此，發酵罐液體菌種在的最佳培養時間為6 d，此時菌絲生物量最大，菌絲生命力旺盛，菌種活力強。

3 討論與小結

不同液體菌種生產技術對靈芝生物量及相關代謝產物或營養成分的影響不同，有研究發現，接種量為10%、發酵周期6 d、pH 5.5時最適宜菌絲生物量和代謝產物的提升[3]；還有研究得出實現多糖高產的最佳發酵溫度為27 ℃、培養基初始pH 6.0、發酵時間144 h[4]。本試驗結果表明，培養溫度為26～28 ℃時菌絲生物量最多，為128.16～132.18 mg/100mL，培養液pH 6 時菌絲生物量達最大值，為121.52 mg/100mL，靈芝的生物學特性表現為偏酸性高溫菌。接種量過低，萌發點少，菌絲物量低；接種量過多，菌絲亦衰老自溶，菌絲生物量亦降低，接種量為4%～6%時菌絲生物量較高，為128.43～132.00 mg/100mL。發酵罐液體菌種的最佳培養時間為6 d，此時生物量最大，為123.60 mg/100mL，菌絲生命力旺盛，菌種活力強。因此，適宜發酵罐液體菌種的培養條件為培養溫度26～28 ℃、培養液pH 6、接種量4%～6%、培養時間6 d。