加工對鐵皮石斛中8種神經毒性農藥殘留的影響

凌淑萍,呂 燕,付 巖,張 亮,王全勝,吳銀良*

(1.寧波市農業科學研究院,浙江寧波 315040;2.寧波市特色農產品質量安全檢測與控制重點實驗室,浙江寧波 315040)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是我國一種名貴中藥材,為蘭科多年生草本植物,莖可入藥[1]。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版記載,鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2]。作為一種藥食同源的作物[3],近年來需求量逐年增加。2020年上半年鐵皮石斛出口量和出口價值分別為13 t和12.08萬美元。為保護鐵皮石斛種質資源,對其進行人工栽培,才可以滿足日益增長的需求[4]。現有登記農藥種類與中藥材病害防治需求相差巨大,導致非登記農藥亂用,甚至高毒禁限用農藥濫用現象存在,造成中藥材上的農藥殘留污染[5],可能對人體健康存在潛在的風險。具有神經毒性的農藥可損害包括皮質、海馬、紋狀體在內的大量中樞神經系統,大劑量接觸后可導致頭昏、頭痛、惡心、嘔吐,嚴重者發生抽搐、昏迷甚至死亡[6]。此外有機磷農藥在長期、低劑量暴露情況下,可致認知功能發生損傷,這種損傷常被忽視,但對患者生活和工作可造成嚴重影響,甚至進展為阿爾茨海默病及帕金森病等不可逆性的神經退行性病變[7]。目前鐵皮石斛中農藥檢測的方法有氣相色譜、三重四極質譜法、液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-串聯質譜法等[8-10]。此外,Fu等[11]使用HPLC-MS/MS分析了戊唑醇、肟菌酯等12種農藥并進行暴露評估。唐靖雯等[12]對貴州鐵皮石斛葉的質量及安全進行評價。

鐵皮石斛鮮品內部含水量較高,易霉變,不易保存和運輸,根據《中國藥典》2020年版,鐵皮石斛采收后,除去雜質,剪去部分須根,邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀,烘干;或切成段,干燥或低溫烘干,前者習稱“鐵皮楓斗”(耳環石斛),后者習稱“鐵皮石斛”[2]。喻明軍等[13]開發了鐵皮石斛低溫烘烤法,使得鐵皮石斛的活性成分更好保留。近年來,對鐵皮石斛加工利用方式增多,鐵皮石斛產品種類增加。如孫傳伯等[14-15]研制出鐵皮石斛酒;施蕊等[16]將石斛葉提取物制成浸膏;陸倩倩等[17]以鐵皮石斛、青錢柳和玫瑰茄為原料,研制出液體口香糖;周兵等[18]將鐵皮石斛制成茶包,方便飲用。魏練平等[19-20]提取鐵皮石斛中的活性物質制備成護眼和抗癌藥物,目前鐵皮石斛市場依然以傳統的鐵皮楓斗為主[21]。雖然鐵皮石斛鮮條采收后,會進行簡單的清洗和搓皮,這些過程只能去除表面部分的農藥殘留,而克百威、吡蟲啉等有些農藥具有內吸性,通過清洗和搓皮不能被有效去除。但是烘烤過程會使作物中的農藥殘留水平發生變化[22]。鐵皮楓斗加工過程最主要的是烘烤,而烘烤對鐵皮石斛農藥殘留加工因子的研究鮮見報道。該研究主要考察吡蟲啉、阿維菌素、茚蟲威等8種具神經毒性的農藥及其代謝物通過模擬鮮條制作成鐵皮楓斗的加工方式,在經12、24和48 h烘烤后,用UPLC-MS/MS測定殘留量并計算加工因子。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Acquity UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜儀、色譜柱Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司);KS4000ic恒溫振蕩器、T25高速勻漿機、GENIUS3旋渦混合器(德國IKA公司);3K15高速離心機(德國Sigma公司);PL1502E電子天平、XPE205十萬分之一電子天平(美國Mettler Toledo公司);BAO-150A鼓風干燥箱(美國STIK公司)。

3-羥基克百威(純度97.16%)、啶蟲脒(純度99.7%)、阿維菌素(純度95.3%)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(純度96.42%)、吡蟲啉(純度99.2%)、茚蟲威(純度98.5%)標樣購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;克百威(濃度1 g/L)購于上海安譜實驗科技股份有限公司;毒死蜱(濃度1 g/L)、三唑磷(濃度1 g/L)購于上海市農藥研究所有限公司;乙腈(色譜純,德國默克公司);甲酸(色譜純,阿拉丁生物科技股份有限公司); 硫酸鎂(分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司);乙酸鈉(分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 農藥殘留加工因子測定采收的石斛鮮條去除根部、葉片、葉梢和花序殘留部分,清洗干凈,放在通風陰涼處晾干。整個莖部分用不銹鋼刀切成小段,并在不銹鋼盆中充分混勻,稱取一定量的混勻樣品,定量添加8種農藥和1種代謝物(3-羥基克百威)的標準溶液,克百威母體與其代謝物單獨添加測定。添加后混合均勻,于70 ℃烘烤,在1和24 h分別取樣,停機4 h,再烘烤24 h,共3次,分別裝入封口樣品容器中,貼好標簽,冷凍保存。試驗重復3次。

為了能夠直觀地表示殘留在加工前后降低或濃縮的情況,通常采用加工因子(processing factor,PF)來表示。加工因子計算公式為:PF=加工食品中農藥殘留量/初級農產品中農藥殘留。

1.3 實驗室樣品制備。

(1)鐵皮石斛鮮條市場樣品。去除根部、葉片、葉梢和花序殘留部分,整個莖部分用不銹鋼刀切碎,并在不銹鋼盆中充分混勻,用四分法縮分樣品,裝入封口樣品容器中,貼好標簽。

(2)鐵皮石斛干樣。將楓斗磨成粉末后裝入樣品盒中,貼好標簽。

1.4 樣品前處理方法50 mL離心管中加入一顆陶瓷均質子,再分別稱取鐵皮石斛鮮樣5.0 g、干樣2.5 g置于離心管中,鮮樣加入純凈水5.0 mL,干樣加入純凈水12.5 mL,振蕩混勻,靜置30 min,加入20.0 mL乙腈劇烈振蕩1 min,加入 6 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉,劇烈振蕩1 min,再以4 200 r/min離心5 min。定量吸取上清液至內含除水劑和凈化劑的塑料離心管中,每1 mL提取液用150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和50 mg C18,渦旋混勻1 min。吸取上清液0.5 mL至另一試管中,用0.1%甲酸溶液定容至1.0 mL,混合均勻,過0.22 μm濾膜后供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.5 標準溶液配制分別稱取9種農藥標準品,用乙腈溶解并定容,分別配成質量濃度為1 000 mg/L標準儲備液。用乙腈將標準儲備液稀釋成100 mg/L標準中間液,于-20 ℃避光保存。用前處理方法制備的鐵皮石斛空白樣品基質稀釋液將標準溶液逐級稀釋成質量濃度為0.100 0、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 mg/L的鐵皮石斛基質標準工作溶液。

1.6 儀器條件色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm); 流動相A相為0.1%甲酸溶液,B相為乙腈; 梯度洗脫條件:B相在1.0 min內保持50%后,在0.1 min內增至80%,保持4.9 min,然后在0.1 min內降至50%,保持1.9 min; 流速0.20 mL/min;進樣量10 μL。電噴霧電離源正離子模式電離; 多反應監測(MRM); 毛細管電壓2.5 kV; 射頻電壓0.5 V; 離子源溫度150 ℃; 脫溶劑氣溫度500 ℃; 錐孔氣流速50 L/h; 脫溶劑氣流速1 000 L/h,其他質譜參數見表1。

表1 農藥分析的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for pesticide analysis

2 結果與分析

2.1 標準溶液曲線與靈敏度用鐵皮石斛干樣空白基質稀釋液將9種標準溶液稀釋成不同質量濃度的基質標準工作溶液,按“1.6”儀器條件進樣檢測,得到峰面積(y)與進樣濃度(x,mg/L)的線性回歸方程,并計算基質效應。結果表明,在濃度范圍內,各化合物峰面積與濃度線性關系良好,線性回歸方程、相關系數(r)和基質效應如表2所示。在上述條件下,根據標準曲線最低檔濃度(0.000 1～0.000 5 mg/kg)和進樣量(10 μL),計算得到各農藥最小檢出量為1.0×10-12～5.0×10-12g。由于大部分農藥存在明顯的基質效應,為了更精確定量,選擇基質匹配標準溶液進行定量。8種農藥及其代謝物的典型離子色譜圖如圖1所示。

表2 8種農藥及其代謝物的線性方程、相關系數和基質效應Table 2 Linear equation,correlation coefficient and matrix effect of 8 pesticides and their metabolite

圖1 8種農藥及其代謝物的典型離子色譜圖Fig.1 Typical ion chromatograms of 8 pesticides and their metabolites

2.2 添加回收率與相對標準偏差該研究基于QuEChERS作為前處理,優化凈化條件、MS/MS參數和流動相體系,建立超高效液相色譜-串聯質譜檢測分析方法。按照“1.4”方法進行前處理。添加濃度為0.01、0.10和1.00 mg/kg,每個添加濃度重復5次,進行添加回收試驗,按“1.6”儀器條件進樣檢測。結果表明,當9種化合物在鐵皮石斛中的添加濃度為0.01 mg/kg時,添加回收率在60%～120%,RSD≤20%;添加濃度為0.10～1.00 mg/kg時,添加回收率在70%～110%,RSD≤15%;表明該方法具有較高的回收率和精密度,可滿足農藥殘留檢測要求。

2.3 加工因子測定該研究對鐵皮石斛加工過程中8種神經毒性農藥及其代謝物進行殘留動態研究,以加工因子表示。結果表明(表3),70 ℃條件下,烘烤12 h,加工因子普遍較高,排前3位的化合物為茚蟲威、三唑磷和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽,平均值分別為5.5、4.8和4.8;烘烤結束(48 h),所有化合物的加工因子在1.0～3.0。

表3 鐵皮石斛農藥殘留加工因子Table 3 Processing factor of the pesticides residues in D.officinale

3 結論與討論

該研究主要通過模擬鐵皮石斛加工工藝,將鮮樣于70 ℃條件下烘烤12～48 h,研究8種神經毒性農藥及其代謝物殘留變化規律。結果表明,在70 ℃條件下,烘烤12～48 h,上述8種農藥及其代謝物均表現為濃縮效應。烘烤12 h,農藥的殘留量最高,說明前12 h以脫水濃縮效應為主。且隨著烘烤時間的延長,水分流失減小,殘留量呈降低趨勢。烘烤48 h,上述所有農藥的加工因子在1.0～3.0。適當地延長烘干時間可降低上述農藥的殘留。然而石斛莖切片干的制作烘烤時間要遠小于傳統鐵皮楓斗的烘烤時間,另外還有低溫烘烤模式的發明和使用,使其農藥的殘留量只會呈現出更明顯的濃縮效應。因此,鐵皮石斛干樣的烘烤制作過程并不能使大部分農藥殘留量減少。雖然清洗和搓皮可以去除表面殘留的農藥,但對于內吸性的農藥,要結合作物的發育階段和病蟲害的嚴重程度,合理確定農藥的使用時間,才能最大程度地減少農藥殘留。將此次試驗加工因子應用于石斛鮮條初級農產品的農藥監測,可估算制成石斛干樣農藥最終殘留,避免沒有達到安全采收期就采收的現象。此外將加工因子數據納入膳食暴露評估模型,可優化膳食評估方法,從而提高評估準確性。該研究為石斛產業的健康發展提供有益借鑒。