保腎通絡方抑制DN 小鼠腎小球炎癥和系膜基質增生減輕腎臟損傷機制研究*

崔方強，王悅芬，蔡朕，孟元，江心燦，趙文景

（首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010）

糖尿病腎病（DN）已經成為中國終末期腎病（ESRD）及透析患者的主要原發腎臟疾病[1]，但目前針對DN 發病的關鍵病理機制缺少相對應的治療措施。研究表明，腎小球炎癥介導的系膜基質增生是DN 發生及進展的重要病理機制[2]。而抑制炎癥減輕系膜基質增生可能成為DN 治療的潛在靶點[3]。中醫藥在防治DN 方面具有獨特的優勢，保腎通絡方為首都醫科大學附屬北京中醫醫院腎病科臨床經驗方，被廣泛應用于臨床防治DN。保腎通絡方治療DN 臨床療效確切，但其防治DN 的分子機制目前尚不清楚。因此本研究觀察了保腎通絡方對于DN 小鼠腎臟病理損傷、腎小球細胞外基質蛋白Ⅳ型膠原蛋白（Collagen Ⅳ）及纖連蛋白（FN）、腎小球炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）水平的影響，進而探討其防治DN 的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本研究應用的KK-Ay 小鼠及C57BL/6J 小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，其中KK-Ay 小鼠30 只，C57BL/6J 小鼠10 只，所有小鼠均為8 周齡SPF 級雄性，體質量為（25±5）g，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0004。小鼠在12 h 光照/黑暗循環，溫度（24±1）℃，濕度50%～70%條件下飼養，并可自由進食進水。本研究已通過實驗動物倫理委員會批準，動物造模及實驗過程嚴格遵守動物福利倫理原則。

1.2 試劑和藥物 Collagen Ⅳ抗體（ab6586，abcam，英國）、FN 抗體（ab2413，abcam，英國）、糖原（PAS）染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0142M）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0105S）、Masson 染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，G1006）、IL-6 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，ml023130）、TNF-α、酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，ml077385）、尿蛋白定量檢測試劑盒（南京建成，C035-2）、肌酐測定試劑盒（ROCHE，瑞士，657881）、尿素氮測定試劑盒（ROCHE，瑞士，658513）、纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號：X1440）；保腎通絡方顆粒劑，由首都醫科大學附屬北京中醫醫院藥劑科制備。

1.3 主要儀器 酶標儀（北京市新風機電技術公司，ZS-3）、離心機（美國Sigma，3K18）、全自動生化分析儀（上海科華生物工程股份有限公司，ZY1280）、倒置顯微鏡（德國Leica 公司，DMILPH1）、凝膠化學發光成像分析系統（法國Vilber 公司，FUSION FX6 XT）、高電流電泳電源（美國伯樂公司，1645052）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立及分組給藥 首先建立DN 小鼠模型，8 周齡雄性KK-Ay 小鼠予高脂飼料喂養，C57BL/6J 小鼠予普通飼料飼養。4 周后檢測各組小鼠血糖及24 h 尿蛋白定量。當KK-Ay 小鼠血糖≥16．7 mmol/L，并且24 h 尿蛋白明顯高于C57BL/6J小鼠時，DN 小鼠模型造模成功。DN 小鼠以血糖、24 h尿蛋白定量并結合體質量進行分層，隨機分為模型組、保腎通絡方組及纈沙坦組，另外將C57BL/6J 小鼠作為正常對照組，每組10 只。保腎通絡方予保腎通絡方顆粒劑灌胃，灌胃劑量為20 g/（kg·d）（生藥劑量），纈沙坦組予10 mg/（kg·d）纈沙坦灌胃，其余兩組予等劑量蒸餾水灌胃，連續灌胃12 周。

1.4.2 標本采集與處理 于灌胃0、4、8 和12 周收集小鼠24 h 尿液，檢測尿蛋白水平。灌胃結束后，小鼠予戊巴比妥麻醉，心尖取血，靜置20 min 左右，離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心20 min，分離血清，后檢測血肌酐及尿素氮水平。摘取腎臟組織，一部分腎組織放入4%多聚甲醛固定，然后石蠟包埋切片，用于免疫組化及腎臟病理檢測，另外部分放入-80 ℃冰箱，用于逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測及ELISA 檢測。

1.4.3 HE、PAS 染色 將石蠟切片進行脫蠟處理，然后將切片放入伊紅或無色鹽基性品紅溶液對切片進行染色，染色結束后流水沖洗，后用蘇木精對細胞核進行染色，程序性脫水透明后，封片，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.4.4 Masson 染色 將石蠟切片進行脫蠟處理，Weigert 鐵蘇木素染色液染核5～10 min，1%鹽酸酒精分化5～15 s，充分水洗，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，用苯胺藍液復染5 min，程序性脫水透明后，封片，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.4.5 酶聯免疫法檢測 將各組小鼠腎組織用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，放置在冰上勻漿，應用離心機4 ℃、12 000×g、離心10 min，取離心后的上清液，應用BCA 蛋白定量試劑盒測定上清液總蛋白濃度，根據ELISA 試劑盒說明書操作步驟對腎組織中的IL-6、TNF-α 水平進行檢測。

1.4.6 免疫組化 首先將石蠟切片脫蠟，然后將一抗稀釋成特定濃度（Collagen Ⅳ1∶1 000；FN 1∶1 000），一抗稀釋液滴加到不同組別切片上，4 ℃孵育過夜，后流水沖洗，加入二抗37 ℃孵育1 h，用蘇木精進行染核，封片。光鏡下觀察蛋白表達水平。

1.4.7 RT-PCR 首先對腎臟總RNA 進行提取，然后將mRNA 反轉錄成為cDNA，對cDNA 進行擴增和熒光定量分析。采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析，所有操作均按照產品說明書進行。利用Primer 5．0 軟件設計引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.5 統計學方法 采用SPSS20．0 進行統計處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD 檢驗，P＜0．05 表示有統計學差異。

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀態比較 正常對照組小鼠毛發光澤，對外界刺激反應靈敏，精神狀態良好；而模型組小鼠毛色晦暗，反應遲鈍，精神萎靡，并出現多飲和形體消瘦；而保腎通絡方組和纈沙坦組小鼠一般狀態均較模型組有不同程度的改善。

2.2 保腎通絡方對DN 小鼠24 h 尿蛋白水平的影響 正常對照組小鼠24 h 尿蛋白水平在整個實驗期間均維持在低水平。與正常對照組相比，模型組小鼠在不同時間節點其24 h 尿蛋白水平均有不同程度升高（P＜0．05），并且隨著時間延長，其尿蛋白水平呈現逐漸升高的趨勢。與模型組相比，保腎通絡方及纈沙坦組小鼠在灌胃4、8 和12 周其24 h 尿蛋白水平均有明顯下降（P＜0．05）。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時間點24 h 尿蛋白的比較（n=10）Fig.1 Comparison of 24 h proteinuria from mice in different groups（n=10）

2.3 保腎通絡方對DN 小鼠血肌酐、尿素氮水平影響 模型組小鼠血肌酐及尿素氮水平較正常對照組明顯升高（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡方組及纈沙坦組小鼠血肌酐、尿素氮水平均有明顯下降（P＜0．05）。見圖2。

圖2 各組小鼠血肌酐（A）及血尿素氮（B）水平比較（±s，n=10）Fig.2 Comparison of Scr(A)and BUN(B)from mice in different groups（±s，n=10）

2.4 保腎通絡方對DN 小鼠腎臟病理的影響 正常對照組小鼠腎小球系膜細胞較少，細胞外基質正常；與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球系膜細胞明顯增多，細胞外基質增生明顯。與模型組相比，保腎通絡方組及纈沙坦組小鼠腎小球系膜細胞減少，細胞外基質增生減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠腎小球腎臟病理改變比較（×200）Fig.3 Comparison of renal pathology from mice in different groups(×200)

2.5 保腎通絡方對DN 小鼠腎小球細胞外基質FN蛋白及mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球細胞外基質FN 蛋白及mRNA 表達明顯上調（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡方組及纈沙坦組小鼠腎小球細胞外基質FN 蛋白及mRNA表達明顯下調（P＜0．05）。見圖4。

圖4 各組小鼠足細胞FN 蛋白（A-B）及mRNA（C）表達水平的比較Fig.4 Comparison of FN protein(A-B)and mRNA(C)expression levels in mice podiocytes in each group

2.6 保腎通絡方對DN 小鼠腎小球細胞外基質Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球細胞外基質Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達明顯上調（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡方組及纈沙坦組小鼠腎小球細胞外基質Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達明顯下調（P＜0．05）。見圖5。

2.7 保腎通絡方對DN 小鼠腎組織TNF-α 及IL-6的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織TNF-α 及IL-6 水平明顯升高（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡方組及纈沙坦組小鼠腎組織TNF-α及IL-6 水平明顯降低（P＜0．05）。見圖6。

圖6 各組小鼠腎組織IL-6（A）及TNF-α（B）水平比較（±s，n=10）Fig.6 Comparison of IL-6(A)and TNF-α(B)expression from mice in different groups（±s，n=10）

3 討論

DN 發病率逐年升高，已經成為導致終末期腎病（ESRD）主要的原發腎臟疾病[4]。目前關于DN 的治療取得了一些進展，包括應用鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2（SGLT-2）抑制劑和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑，但這些藥物在中重度腎功能受損患者仍需減量或者停藥[5]。此外盡管采取了以上積極早期的臨床干預措施，仍有很多患者快速進入ESRD。因此積極探討DN 的發病機制，進而尋求其潛在治療靶點及新的治療策略顯得尤為重要。

腎小球系膜細胞增多及細胞外基質增生是DN特征性的病理改變[6]。其中細胞外基質增生是導致DN 腎小球纖維化及疾病進展的重要病理機制[7]。腎小球細胞外基質主要包括Collagen Ⅳ和FN，其中FN 是一種大分子糖蛋白，廣泛存在于細胞外基質、基膜及體液中，并在細胞外基質中相互交叉，形成網絡，為其他細胞外基質成分沉積提供支架[8]。Collagen Ⅳ是一種基膜膠原，存在于上皮細胞、血管內皮細胞基膜中。Collagen Ⅳ同時也是腎小球系膜基質及基底膜的主要成分，其在系膜細胞間相互交叉呈網狀結構[9]。生理情況下，腎小球細胞外基質生成和降解處于動態平衡。在DN 中，腎小球系膜細胞外基質生成增多，降解減少，進而引起細胞外基質累積。而抑制腎小球細胞外基質蛋白FN 及Collagen Ⅳ生成，減輕細胞外基質增生可以有效的延緩DN 疾病進展[10]。

炎癥介導腎小球系膜基質增生是DN 發生及進展的重要病理機制。DN 患者腎小球處于一種局部的、非顯性的慢性低度炎癥，并非由病原微生物引起，而是與多種致炎因子相關的免疫性炎癥[11]。研究發現，高糖等病理因素會引起巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞在腎小球浸潤，并釋放相關炎性因子[12]。而炎性因子可作用于腎臟固有細胞，引起系膜細胞增殖及細胞外基質增生，進而引起腎小球纖維化，最終導致蛋白尿的產生及腎功能的進展[13]。其中IL-6 及TNF-α 是介導DN 腎小球炎癥及系膜基質增生的重要炎性因子。研究發現，DN 患者IL-6 水平較無腎臟損傷人群明顯升高，且隨著IL-6 水平的升高，其腎小球系膜細胞基質增生呈現逐漸加重趨勢[14]。TNF-α 不僅可以直接介導系膜細胞損傷，同時可以刺激成纖維細胞生長和局部膠原的增加，在腎纖維化中發揮作用[15]。

中醫藥在防治DN 方面具有獨特的優勢，并顯示出較好的減輕炎癥抑制系膜基質增生作用[16-17]。全國名老中醫張炳厚教授長期從事中醫藥防治DN 的臨床研究工作，提出“腎氣精兩虛，腎失封藏，腎絡閉阻”是DN 發病的核心病機，并主張治療糖尿病腎病應采用補腎活血通絡的治療原則。保腎通絡方是在補腎活血通絡的治則指導下組方而成，由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹參組成，本研究在補腎藥物基礎上加入蟲蟻通絡藥和辛潤通絡藥。方中熟地黃滋陰補腎，重用為君藥，黃芪健脾益氣，菟絲子補腎澀精，三者配伍，共奏益氣養陰、補益脾腎之效，加用丹參、劉寄奴、鬼箭羽活血化瘀通絡，但糖尿病腎病腎絡閉阻日久，單憑草木之力難以起效，加用水蛭加強通絡之力。臨床試驗已經證實，保腎通絡方對于DN 患者具有較好的降低尿蛋白、改善腎功能的作用[18]。此外基礎實驗證實，保腎通絡方能夠減輕DN 小鼠足細胞損傷，延緩疾病進展[19]。但是保腎通絡方對DN 腎小球炎癥及系膜基質增生的作用目前并不清楚。

因此，課題組進行了前期動物實驗研究，設立了保腎通絡方低、中、高劑量組，實驗結果證實，中劑量組[20 g/（kg·d）]小鼠腎功能改善明顯優于其他兩個劑量組，因此本實驗中保腎通絡方的給藥劑量為20 g/（kg·d）。研究結果顯示保腎通絡方能夠顯著降低DN 小鼠蛋白尿，降低DN 小鼠血肌酐、血尿素氮水平。此外保腎通絡方可以降低DN 小鼠腎小球系膜細胞數目，減輕腎小球細胞外基質增生，改善腎臟病理。基于FN 及Collagen Ⅳ在DN 腎小球細胞外基質增生中的重要作用，本課題觀察了不同組別小鼠腎小球FN 及Collagen Ⅳ的表達情況。結果顯示，保腎通絡方能夠明顯下調DN 小鼠腎小球FN及Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達。與此同時，保腎通絡方可以降低DN 小鼠腎組織炎性因子IL-6 及TNF-α 水平。本實驗研究結果表明，保腎通絡方能夠降低DN 蛋白尿，保護腎功能。同時保腎通絡方能夠下調FN 和Collagen Ⅳ表達，降低炎性因子IL-6和TNF-α 水平，減輕腎小球炎癥及系膜基質增生。至于其減輕DN 腎小球炎癥和系膜基質增生的詳細的分子機制有待進一步研究。