蒼附導痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠oatp4a1、代謝紊亂與腸道菌群的影響*

馬思明，閆穎，張晗，哈虹

（天津中醫藥大學第一附屬醫院婦科，天津 301617）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種內分泌代謝異常的綜合性疾病，主要發病人群為青春期和育齡期女性，占育齡婦女的6%～20%，該病是導致患者不孕的主要原因，給患者及其家庭帶來了沉重的心理負擔[1]。PCOS 因其有臨床癥狀特異、病因復雜、影響因素多樣的特點，其發病機制至今仍不明確，但研究證實該病不僅是最常見的婦科內分泌疾病外，還是一種以肥胖、胰島素抵抗等為特點的代謝性疾病，影響患者一生[2]。中醫理論認為，肥胖患者因長期飲食肥甘厚膩，使之痰濁內生、濕濁內停，故肥胖患者多痰濕，而有機陰離子轉運多肽4a1（oatp4a1）作為機體關鍵的膜轉運蛋白，在維持機體內外水液代謝平衡中發揮著重要作用，可高效運轉毒素、食物和藥物等代謝產物、內分泌產物等“濕濁”，故可推測其可能在PCOS 中扮演重要角色[3]。PCOS 作為一種代謝綜合征，其代謝紊亂普遍存在，而PCOS 患者代謝紊亂主要表現為糖脂代謝紊亂，故如何改善其糖脂代謝紊亂一直是臨床工作的重中之重[4]。近年來隨著中國測序技術的不斷發展，研究發現腸道菌群的變化與人類多種代謝性疾病的發生、發展密切相關，PCOS 也不例外，因此近年來其已經成為醫學領域的研究焦點及熱點[5]。而蒼附導痰湯是治療形肥痰盛的經典方劑，具有健脾行氣、化痰燥濕之功效，且已有研究證實其在PCOS 治療方面具有顯著效果[6]，但作用機制尚不明確。因此本文就蒼附導痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠oatp4a1、代謝紊亂與腸道菌群的影響進行研究探討，為臨床預防及治療PCOS 提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物材料 本實驗選取南京君科生物工程有限公司提供的50 只SPF 級SD 雌性大鼠[合格證書為：SCXK（蘇）2019-0005]，平均體質量190～250 g，大鼠單籠喂養，室溫生長，模仿晝夜交替，晝夜各12 h，在常溫下進行無菌自由進食、飲水2 周，按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。實驗方案獲得天津中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗倫理委員會批準（倫理審批號：20210314）。

1.2 實驗材料 脫氫表雄酮（DHEA）（貨號：E03788，上海瓦蘭有限公司）；蒼附導痰湯（本院自制，為水煎劑，生藥含量為0．86 g/mL）；蘇木素染液（貨號：H9627，美國Sigma 公司）；伊紅染液（貨號：AG1100-100 mL，上海吉至有限公司）；光學顯微鏡（型號：CX-60，日本OLYMPUS 公司）；免疫組化試劑盒（貨號：YDDEF001，上海羽哚有限公司）；oatp4a1 抗體（貨號：BMP088，山東華博基因工程有限公司）；血糖儀（型號：KQT-6 型，北京安騰有限公司）；放射免疫試劑盒（貨號：SHXFFMDC01，上海信帆有限公司）；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：446502，美國R＆D 公司）；多功能酶標儀（美國Molecular D evices 公司，型號：BX-53）；腸球菌選擇性培養基（貨號：028961，廣東環凱有限公司）；腸桿菌選擇性培養基（貨號：028700，廣東環凱有限公司）；乳酸桿菌選擇性培養基（貨號：PJ0458，北京普非有限公司）；雙歧桿菌選擇性培養基（貨號：GRP0289，上海廣銳有限公司）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 造模 選取40 只SPF 級SD 雌性大鼠，于背部皮下注射5 mg/100 g DHEA，每日1 次，且每日以特制高脂飼料進行喂養，連續30 d，在建模15 d 后，開始對大鼠進行連續陰道涂片用以觀察其動情期，當大鼠陰道上皮細胞持續角化，始終處于動情間期，失去規律的動情周期變化時，則視為造模成功，造模過程中無大鼠死亡，全部造模成功。

1.3.2 分組及給藥 從造模成功的大鼠中隨機選取30 只，將其分為模型（M）組，低劑量蒼附導痰湯（D）組，高劑量蒼附導痰湯（H）組，每組10 只，同時選取剩余正常大鼠10 只作為正常（N）組，對D 組灌胃1．42 g/kg 蒼附導痰湯，對H 組灌胃5．68 g/kg 蒼附導痰湯，兩組均每日1 次，連續2 周，N 組、M 組同期給予同體積生理鹽水灌胃。從第6 天開始，每天8：00、15：00、22：00 對4 組均進行陰道涂片，持續15 d，觀察并記錄大鼠動情期、動情前期。

1.3.3 標本采集 實驗完成后，收集新鮮糞便樣本置于滅菌的離心管內，于-80 ℃冰箱保存，然后禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉處死并稱質量，取出雙側卵巢組織稱質量，按照公式計算，卵巢指數=兩側卵巢總質量（mg）/大鼠體質量（g），固定、洗凈后放入冰箱密封保存，同時腹主動脈取血，在4 000 r/min 條件下離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，放入-80 ℃冰箱中密封保存。

1.3.4 蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測卵巢組織病理形態 取右側卵巢，進行常規石蠟包埋、切片，60 ℃烤箱中1 h 行微波抗原修復，脫蠟、透明、脫水，蒸餾水清洗1 min，用蘇木素染液進行HE 染色，中性樹膠封片后，用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.3.5 免疫組化法檢測oatp4a1 蛋白表達 取左側卵巢，進行常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化處理后，用過氧化氫溫室孵育10 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3 次，微波熱修復后，在37 ℃，2%BSA 條件下封閉30 min，加入稀釋的oatp4a1 一抗（1∶100），4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜，加入稀釋的生物素標記的二抗（1∶100），37 ℃輕搖室溫孵育30 min 洗膜，用二氨基聯苯胺（DAB）進行顯色，顯色完成后，PBS 洗滌3 次，蘇木精復染5 min，中性樹膠封片后，用光學顯微鏡進行觀察。

1.3.6 代謝紊亂相關指標檢測 取各組大鼠血清，血糖儀檢測空腹血糖（FBG），嚴格按照儀器說明說進行檢測；放射免疫試劑盒測定空腹胰島素（FINS），嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，當檢測完成后，測定放射性強度，繪制標準曲線并計算其含量；ELISA 試劑盒檢測脂聯素（APN），嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，檢測完成后，立即在波長450 nm 處用酶標儀，測定每孔吸光度，繪制標準曲線并計算其含量；并按公式[胰島素抵抗脂數（HOMA-IR）=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）÷22．5]計算胰島素抵抗指數。

1.3.7 腸道菌群檢測 取各組大鼠糞便（每次取0.1 g），用生理鹽水稀釋100 倍，然后進行10 倍系列稀釋，稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液，采用微量加樣器吸取10-3、10-4、10-5稀釋程度的標本滴加至腸球菌選擇性培養基，吸取10-3、10-4、10-5稀釋程度的標本分別滴加至腸桿菌選擇性培養基、乳酸桿菌選擇性培養基、雙歧桿菌選擇性培養基，腸桿菌及腸球菌在37 ℃、需氧條件下培養24 h，乳酸桿菌及雙歧桿菌在37 ℃。厭氧條件下培養48 h，培養完成后，用平板菌落計數法計算各個稀釋平板內的菌落數，計算結果以對數形式表示。實驗在天津中醫藥大學實驗室進行，實驗室等級為1 級生物安全防護實驗室，實驗時注意事項：1）檢測需要無菌操作。2）每次檢測都需要陰性對照。3）注意觀察氣體是否排完全。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism8.0 對各組大鼠oatp4a1、代謝紊亂與腸道菌群相關指標進行統計分析，實驗數據采用均數±標準差（±s）多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠動情期及卵巢指數結果 與N 組比較，M 組大鼠動情前期、卵巢指數明顯升高（P＜0.05），動情期明顯降低（P＜0.05），與M 組比較，D 組、H 組大鼠動情前期、卵巢指數顯著降低（P＜0.05），動情期顯著升高（P＜0.05），且H 組比D 組變化明顯（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動情期及卵巢指數（±s）Tab.1 Estrus and ovarian index of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠動情期及卵巢指數（±s）Tab.1 Estrus and ovarian index of rats in each group（±s）

注：N 組為正常組，M 組為模型組，D 組為蒼附導痰湯低劑量組，H 組為蒼附導痰湯高劑量組。與N 組相比，*P＜0.05；與M 組相比，#P＜0.05；與D 組相比，△P＜0.05。

組別 動物數動情期（h）動情前期（h）卵巢指數N 組1012.35±2.1218.38±1.6624.36±2.13 M 組105.81±1.52*29.37±2.25*35.31±3.15*D 組108.25±1.35*#25.25±2.01*#29.96±2.47*#H 組1011.23±1.85*#△ 19.23±1.84*#△ 25.44±2.25*#△

2.2 各組HE 染色結果 N 組大鼠卵巢組織及卵泡生長正常，可見多個黃體和不同發育時期卵泡，且間質正常，間質中可見深染的肥大細胞，M 組大鼠可見卵巢皮質呈多囊樣改變，黃體數量明顯減少，可見較多的閉鎖卵泡，卵泡細胞多為壞死、增厚，D 組、H 組大鼠卵巢病理顯著改善，黃體數量逐漸增多。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織結構病理形態（HE 染色，×400）Fig.1 Pathological morphology of ovarian tissue structure in each group of rats(HE staining，×400)

2.3 各組大鼠oatp4a1 蛋白表達結果 大鼠卵巢組織oatp4a1 蛋白表達量分別為N 組（2.33±0.21）、M 組（1.14±0.11）、D 組（1.68±0.15）、H 組（2.24±0.19）（F=15.870，P＜0.001），與N 組比較，M 組大鼠卵巢組織oatp4a1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），與M 組比較，D 組、H 組大鼠卵巢組織oatp4a1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），且H 組比D 組顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織oatp4a1 蛋白表達（免疫組化染色，×400）Fig.2 Oatp4a1 protein expression in ovarian tissue of rats in each group(immunohistochemical staining，×400)

2.4 各組大鼠代謝紊亂相關指標結果 與N 組比較，M 組血清中FBG、FINS、HOMA-IR 顯著升高（P＜0．05），APN 顯著降低（P＜0．05），與M 組比較，D 組、H 組血清中FBG、FINS、HOMA-IR 顯著降低（P＜0．05），APN 顯著升高（P＜0．05），且H 組比D 組變化顯著（P＜0．05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中FBG、FINS、APN、HOMA-IR水平（±s）Tab.2 FBG，FINS，APN，HOMA-IR levels in serum of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠血清中FBG、FINS、APN、HOMA-IR水平（±s）Tab.2 FBG，FINS，APN，HOMA-IR levels in serum of rats in each group（±s）

注：N 組為正常組，M 組為模型組，D 組為蒼附導痰湯低劑量組，H 組為蒼附導痰湯高劑量組。與N 組相比，*P＜0．05；與M 組相比，#P＜0．05；與D 組相比，△P＜0．05。

組別 動物數FBG（mmoL/L）FINS（μIU/mL）APN（mg/L）HOMA-IR N 組10 4．36±0．8323．09±2．016．36±1．635．36±1．13 M 組10 6．31±1．65* 35．31±3．15* 3．31±0．85* 9．31±1．75*D 組10 5．25±1．35*# 29．25±2．35*# 4．55±1．35*# 7．25±1．35*#H 組10 4．43±1．05*#△24．23±2．15*#△6．23±1．57*#△5．83±1．25*#△

2.5 各組大鼠腸道菌群結果 與N 組比較，M 組大鼠腸桿菌數量顯著升高（P＜0．05），腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數量明顯降低（P＜0．05），與M 組比較，D 組、H 組大鼠腸桿菌數量顯著降低（P＜0．05），腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數量明顯升高（P＜0．05），且H 組比D 組變化顯著（P＜0．05）。見表3。

表3 各組大鼠腸道菌群結果（±s）Tab.3 Results of gut microbiota of rats in each group（±s） Log CFU/g

表3 各組大鼠腸道菌群結果（±s）Tab.3 Results of gut microbiota of rats in each group（±s） Log CFU/g

注：A 為正常組，B 為模型組，C 為蒼附導痰湯低劑量組，D 為蒼附導痰湯高劑量組。與N 組相比，*P＜0．05；與M 組相比，#P＜0．05；與D 組相比，△P＜0．05。

組別 動物數腸桿菌腸球菌乳酸桿菌雙歧桿菌N 組106．75±0．849．59±1．6810．88±1．849．66±1．71 M 組109．88±1．72* 6．34±0．81*7．26±1．03* 6．14±0．84*D 組108．01±1．31*# 7．22±1．21*#8．15±1．26*# 7．18±1．35*#H 組106．92±1．02*#△9．21±1．63*#△10．61±1．68*#△9．45±1．59*#△

3 討論

PCOS 是臨床常見疾病，近年來隨著人們生活方式的不斷變化，該病的就診率不斷增高，且正在向年輕化發展，因此早預防、早診斷、早治療就顯得尤為重要，這將對提高患者生存質量，降低家庭及社會負擔具有積極意義[7]。而近年來研究發現，中醫藥在治療PCOS 方面發揮重要作用，故中醫藥越來越受到廣大醫學專家的重視[8]。因此，文章就蒼附導痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠oatp4a1、代謝紊亂與腸道菌群的影響進行研究探討，為臨床治療PCOS 提供理論基礎。

本研究發現，蒼附導痰湯可有效改善大鼠動情周期及卵巢病理形態，降低卵巢指數，并促進oatp4a1 蛋白表達，療效顯著。PCOS 在中醫中雖無具體名稱，但根據其疾病特征可歸屬于中醫“閉經”“月經過少”“不孕”“月經后期”等范疇，中醫認為該病病機在于腎虛、脾虛、肝郁、痰濕等，故治療多以補腎調經、補氣健脾、疏肝解郁、燥濕化痰為主[9]。眾所周知，肥胖是PCOS 的典型特征，其可使患者病程持續加重，而肥胖的病理基礎是水液代謝平衡紊亂導致的痰濕，因此如何改善機體水液代謝是近年來醫學領域關注的焦點之一[10]。oatp4a1 是溶質載體超家族的重要成員，可高效運轉多種異體代謝產物，在維持機體水液代謝平衡方面發揮重要作用，研究發現，其功能失調可引起“痰濁”的分布、吸收以及排泄障礙，從而導致多種疾病的發生，PCOS 也不例外，故其越來越受到臨床的重視[11]。蒼附導痰湯來源于《葉天士女科診治秘方》，方中香附、蒼術為君藥，具有健脾燥濕、疏肝解郁、行氣寬中，共奏調和肝脾之功；茯苓健脾滲濕，助脾運化水濕，使之無以生痰，陳皮、枳殼理氣行滯，以助健脾消痰，膽南星清熱化痰，以治痰瘀化熱，共為臣藥；生姜、神曲為佐藥，溫中化痰、消積導滯；甘草健脾益氣祛痰，調和諸藥，可解半夏、南星之毒，全方共達健脾祛濕化痰之功效，在治療痰濕型閉經、肥胖方面具有顯著療效[12]。對于PCOS 大鼠，蒼附導痰湯通過其健脾燥濕，理氣化痰之功效，調節胃腸功能穩態，從而抑制炎癥反應、抑制氧化應激、改善機體代謝水平，進而有效促進oatp4a1 合成及分泌，達到改善水液代謝平衡的目的，最終有效改善臨床癥狀。

研究結果顯示，與M 組比較，D 組、H 組血清中FBG、FINS、HOMA-IR 顯著降低，APN 顯著升高，且H 組比D 組變化顯著，這說明蒼附導痰湯可顯著改善大鼠代謝紊亂。PCOS 在生育年齡的早期，主要癥狀表現為月經紊亂，尤其是月經稀發，高雄激素血癥和不孕，然而到生育年齡晚期以及圍絕經期，代謝綜合征將替代不孕影響33．4%～47．3%的患者，故代謝紊亂已被普遍認為是PCOS 的關鍵病理、生理改變[13]。而研究表明，糖脂代謝紊亂在PCOS 患者中最為常見，其中糖代謝紊亂主要表現為糖代謝異常及胰島素抵抗，數據顯示，胰島素抵抗存在于50%～80%的PCOS 患者，是促進代謝綜合征發展的重要因素，故本研究選擇FBG、FINS、HOMA-IR 作為反映糖代謝水平的指標；APN 作為唯一由脂肪組織分泌的蛋白質，其不僅對卵巢功能具有潛在性作用，PCOS患者肥胖、高雄激素血癥、脂肪分布異常等也都與其密切相關，故其可作為反映脂代謝紊亂的有效指標[14-15]。而對于PCOS 大鼠，蒼附導痰湯可能是通過健脾祛濕化痰功效，來維持機體代謝平衡，從而抑制卵巢雄性激素相關合成酶StAR 表達、促進胰島素信號傳遞、調控生殖激素分泌，進而改善胰島素代謝功能、血糖、血脂指標，最終有效改善代謝紊亂及疾病癥狀。

本文研究表明，與M 組比較，D 組、H 組大鼠腸桿菌數量顯著降低，腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數量明顯升高，且H 組比D 組變化顯著，這說明蒼附導痰湯可顯著改善大鼠腸道菌群。腸道菌群被稱為“被遺忘的器官”，是環境因素影響人類健康以及疾病的重要媒介之一，正常的腸道菌群對維持機體健康極為重要，其可有效抵御病原菌入侵，分解并排出毒害物質，此外其還與機體代謝、內分泌、神經系統關系密切[16]。近年來國內外研究發現，PCOS 患者中存在腸道菌群紊亂，其構成與正常人群具有顯著差異，腸桿菌數量有下降趨勢，腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌有上升趨勢，這提示其可能在PCOS 發生、發展中發揮重要作用，且還可能是引起胰島素抵抗的主要因素[17]。而對于PCOS 大鼠，蒼附導痰湯可能是通過改善胃腸道功能，來改善胃腸黏膜通透性，從而維持腸道免疫平衡、抑制炎癥反應、抑制內毒素產生等，進而達到改善腸道菌群的目的，最終有效抑制PCOS 的發生、發展。

綜上所述，蒼附導痰湯可顯著促進多囊卵巢綜合征大鼠oatp4a1 蛋白表達，改善大鼠代謝紊亂和腸道菌群。但本研究仍然存在一定不足，比如樣本量、研究指標較少，只對oatp4a1 蛋白表達進行檢測等，研究內容需進一步完善，在今后的研究中應該增加實驗樣本，通過多元化實驗方案為臨床治療提供有力的臨床依據。