基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 和網絡藥理學探討益氣祛風方治療糖尿病腎病作用機制*

朱荔煒，王春國，洑曉哲，黃為鈞，李瀟然，趙進喜

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）最常見的微血管并發癥之一，目前已成為全球引起終末期腎臟病的主要原因[1]。發揮中醫藥的優勢，探索中醫藥方法治療DN 十分必要。

DN 屬于“消渴病”并發“水腫”“關格”等疾病范疇。趙進喜教授在繼承國醫大師呂仁和教授關于DM 微血管并發癥“微型癥瘕形成”理論的基礎上，通過臨床實踐與證候學研究，發現絡脈“微型癥瘕”形成的過程中，“風邪”亦為導致DN 進展的另一重要致病因素，因此提出“腎絡伏風”致病假說。在此基礎上繼承前人臨床經驗和學術思想，提出“從風論治”DN 的治療思路[2-4]，在臨床應用中取得良好療效。代表方劑益氣祛風方具有益氣活血、祛風通絡的功效，既往研究發現該治法具有一定的降低蛋白尿、延緩腎小球纖維化的作用，其機制與調控胞內磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號轉導通路、P38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路相關[5-8]。由于中藥作為天然產物，活性成分復雜，干預DN 的機制往往是多靶點、多途徑的，因此益氣祛風方減少蛋白尿、延緩DN 病程進展的機制仍待進一步完善。

網絡藥理學融合多學科理論和技術，其整體性、系統性的特點與中醫藥整體觀念原則一致，可用于研究中藥復方多成分、多靶點、多途徑協同作用的生物網絡關系[9]。本研究采用超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道阱質譜儀（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技術對益氣祛風方中主要化學成分進行快速分析，基于實測化學成分采用網絡藥理學研究方法進行靶點預測和功能分析，通過分子對接技術判斷受體-配體結合度，探討本方的藥效物質和作用機制，為DN 的中醫藥臨床治療和益氣祛風方的實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS：配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 4．2 化學工作站（美國Thermo Scientific 公司）；Vanquish 超高效液相色譜系統：含二元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，DAD 檢測器（美國Thermo Scientific 公司）。Millipore Synergy UV 型超純水機（美國Millipore 公司）；KH5200E 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

益氣祛風方藥物生黃芪（批號：20102201）、穿山龍（批號：00251101）、炒牛蒡子（批號：2008062）、蟬蛻（批號：20092401）、鬼箭羽（批號：19090504）和燙水蛭（批號：20072001）飲片均購于北京中醫藥大學東直門醫院藥房。甲酸、甲醇、乙腈等試劑均為質譜純（美國Fisher 公司）。白細胞介素（IL）-1β（SC-52012）、趨化因子配體5（CCL5）（SC-365826）、核因子-κB（NF-κB）（SC-8414）購于Santa Cruz；IL-6（bs-0782R）、β-actin（bs-0061R）購于Bioss；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠免疫球蛋白g（IgG）（SA00001-1）、HRP 標記羊抗兔IgG（SA00001-2）購于Proteintech。

1.2 實驗動物 6 周齡SPF 級雄性db/db 小鼠及db/m 小鼠，初始平均體質量25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006]。

1.3 數據庫及軟件 PubChem 數據庫（https：//pub chem．ncbi．nlm．nih．gov/）；中藥系統藥理學分析數據庫TCMSP（https：//tcmspw．com/tcmsp． php）；SwissADME（http：//www．swissadme．ch//）；Swiss Target Prediction（http：//www．swisstargetprediction．ch/）；人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//www．omim．org/）；人類基因數據庫（GeneCards，https：//www．genecards．org/）；STRING數據庫（https：//string-db．org/）；Metascape 數據庫（http：//metascape．org/）；RCSB PDB 數據庫（https：//www．rcsb．org）；AlphaFold 數據庫（https：//alphafold．ebi．ac．uk/）；Cytoscape 3．9．1 軟件（https：//cytoscape．org/）；CB Dock 平臺（http：//clab．labshare．cn/cb-dock/php/index．php）；微生信在線平臺（http：//www．bioinformatics．com．cn/）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 益氣祛風方配方比例為生黃芪∶穿山龍∶牛蒡子∶蟬蛻∶鬼箭羽∶水蛭=10∶10∶5∶4∶4∶1，加10 倍量水煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，濃縮和真空干燥（70 ℃，真空度為0．08 MPa），提取得率為19．66%。粉碎，過60 目篩，即得中藥干膏。取粉末約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超聲提取30 min，放冷，搖勻，離心，取上清液過0．22 μm 濾膜，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動相：0．1%甲酸水溶液（A），乙腈溶液（B）；梯度洗脫條件：0～3 min（5%～5%B），3～45 min（5%～75%B），45～45．1 min（75%～5%B），45．1～50 min（5%～5%B）；流速：0．3 mL/min；進樣量：3 μL；柱溫：35 ℃。

2.3 質譜條件 正離子檢出模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350 ℃，噴霧電壓3．5 KV，S-Lens RF電壓60 V，毛細管溫度300 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99．99%），鞘氣流速：40 arb，輔助氣流速流速：20 arb；負離子檢出模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350 ℃，電離源電壓3．2 KV，S-Lens RF 電壓60 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99．99%），鞘氣流速：35 arb，輔助氣流速流速：10 arb。

掃描模式：一級全掃描（Full Scan，m/z 100-2 000）與數據依賴性二級質譜掃描（data-dependent acquisistion）ddMS2；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD），碰撞能量：NEC30，Stepped NEC50%。

2.4 化學成分的鑒定及其活性成分的篩選 通過Xcalibur 軟件進行數據的采集，經與自建數據庫檢索進行數據解析。中國知網、萬方、維普網及PubMed 數據庫檢索并構建益氣祛風方原藥材相關化學成分數據庫，在Compound Discoverer 3．1 軟件檢索在線及構建的化合物數據庫，并比對精確相對分子質量，根據參考文獻提供的保留時間及二級碎片離子信息進行確證。

2.5 藥物活性成分靶點篩選、DN 疾病靶點預測 將上一步藥物質譜分析得到的成分逐一輸入PubChem 數據庫，獲得分子結構并以*．sdf 格式保存。將*．sdf 格式文件上傳至Swiss ADME 平臺，使用TCMSP 平臺進行補充，獲得吸收度及類藥性等相關參數，篩選吸收度高、類藥性好的成分。將篩選后成分的*．sdf 格式文件導入Swiss Target Prediction平臺，設置屬性為“Homo sapiens”，收集預測到的所有靶點，同時在TCMIP、HERB 等數據庫檢索成分名稱，補充相關靶點，整合后得到藥物活性成分靶點庫。以“Diabetic Nephropathies”為關鍵詞在Gene Card 數據庫及OMIM 數據庫中檢索相關疾病靶點，將搜索結果整合去重獲得DN 疾病靶點預測庫。通過R 語言將藥物活性腳本和疾病靶點取交集并繪制韋恩圖，得到藥物-疾病交集靶點。

2.6 核心靶點篩選及蛋白相互作用網絡構建 將藥物-疾病交集靶點導入String 平臺，設置物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“Highest confidence（0．90）”，構建蛋白相互作用網絡（PPI）。將該網絡導入Cytoscape3．9．1 軟件，使用“Analyze Network”進行網絡拓撲學分析，利用連接度（degree）、介數中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）3 個拓撲參數進行篩選，獲得核心基因靶點。

2.7 基因本體（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用Metascape數據庫對核心靶點基因進行GO 功能分析和KEGG通路富集分析，物種為“Homo sapiens”，設定P＜0．01，分析益氣祛風方的治療DN 涉及的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組成（CC）和通路，根據富集基因數目由多到少進行降序排列，利用微生信平臺對位居前列的生物學過程和通路繪制GO 功能富集分析柱狀圖和KEGG 通路富集分析氣泡圖。

2.8 益氣祛風方主要成分篩選與關鍵靶點分子對接 2．6 中形成PPI 靶點對應的成分即為主要成分。從RCSB PDB 數據庫或AlphaFold 數據庫獲得核心靶點的晶體結構，與2．5 中獲得的活性成分的sdf式，通過CB Dock 進行分子對接[10]，分析結合能。結合能體現兩者能否形成穩定對接結構，故如結合能＜-5 kcal/mol 則說明結合構象相對穩定。

2.9 動物實驗驗證 db/db 小鼠普通飼料無干預適應性飼養2 周，自由攝食飲水。2 周后，禁食不禁水6 h 后測定小鼠空腹尾尖血糖，≥16．7 mmol/L 為造模成功，隨機分為模型組、益氣祛風方組，db/m 小鼠為空白組，每組6 只。db/db 小鼠給藥劑量換算后灌胃益氣祛風方干膏粉3．04 g/（kg·d），db/m 小鼠灌胃等量生理鹽水，共干預8 周。提取腎組織總蛋白進行Western Blotting，加入冰盒控制電轉溫度，將轉好的PVDF 膜于慢搖床上用5%的脫脂牛奶封閉1 h。稀釋一抗IL-1β（1∶300）、CCL5（1∶300）、NF-κB（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃封閉過夜。TBST 清洗5 次，每次5 min，室溫孵育二抗90 min，TBST 清洗5 次。ECL 顯色液激發PVDF 膜1 min，進行曝光、顯影、拍照，使用ImageJ 分析灰度值以反映不同組別間蛋白表達量。使用GraphPad Prism 9 進行統計分析，P＜0．05 為差異性判斷標準，以P＜0．05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 益氣祛風方活性成分分析及篩選 從益氣祛風方中共鑒定出115 個化學成分，總離子流圖見圖1，鑒定信息見開放科學計劃（OSID）二維碼。通過PubChem 數據庫獲得所有成分的CID、Canonical SMILES 及分子結構文件（*．sdf），導入Swiss ADME平臺，在結果中篩選GI absorption 為“High”（即消化道吸收度高），用于篩選口服生物利用度較好的活性化合物；篩選Druglikeness 預測中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge5 項有2 項或2 項以上為“Yes”的化合物，選擇具有較好類藥性的化合物，共得到滿足條件的活性成分66 個。在TCMSP 中檢索GI absorption 為“Low”（即消化道吸收度低）的成分，補充牛蒡子苷（Arctiin，OB 34．45%，DL 0．84）及香蜂草苷（Didymin，OB 38．55%，DL 0．24）。根據文獻補充黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ[11]、山奈苷[12]、柳穿魚黃素[13]、京尼平苷[14]、纖細薯蕷皂苷[15]、粗糠柴苦素[16]及大豆皂苷Ⅰ[17]。這些成分雖然消化道吸收度低，但有文獻報道其通過口服途徑取效，故納入后續分析。共篩選得到76 個成分。

圖1 益氣祛風方中UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鑒定的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Yiqi Qufeng Formula by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

3.2 益氣祛風方治療DN 的潛在作用靶點預測 將上一步篩選得到的76 個成分SDF 格式文件導入Swiss Target Prediction 平臺，同時使用TCMIP、HERB 平臺檢索化合物名稱補充靶點，整合預測結果，共預測到作用靶點5 064 個。根據預測所得靶點的“Probability”值，取中位數（0．111 5）以上的靶點共2 688 個，去重后共得到作用靶點615 個。

通過Gene Cards 數據庫檢索得到疾病相關靶點，結合OMIM 數據庫補充，合并后刪除重復值，得到相關靶點4 911 個。篩選“Relevance score”為中位數（3．549 8）以上的靶點，最終得到DN 相關靶點共2 025 個。將活性成分作用靶點與DN 相關靶點取交集，獲得益氣祛風方治療DN 的潛在靶點266 個，并使用R 語言繪制韋恩圖，見圖2。

圖2 益氣祛風方治療DN 的潛在作用靶點Fig.2 Potential targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

3.3 益氣祛風方治療DN 的主要成分及核心靶點篩選 將266 個潛在作用靶點輸入STRING 數據庫，設置最小相互作用閾值為“Highest confidence（0．90）”并隱藏游離節點后，保留227 個靶點，1 133 條連線，average node degree=8．52，PPI enrichment Pvalue＜1．0e-16，得到潛在作用靶點PPI 網絡圖，見圖3。這227 個靶點對應的活性成分即為主要成分，部分成分信息見表2。將該蛋白互作網絡導入Cytoscape3．9．1，選擇介數中心性、接近中心性、連接度均大于中位數的靶點，即介數中心性≥0．010 525 717、接近中心性≥0．412 322 275、連接度≥6，篩選得到78 個靶點，即為益氣祛風方治療DN 的核心靶點。3 個拓撲學參數中，介數中心性表示點在其他點之間的中介調節效應，數值越大表明網絡節點間的聯系經過該點次數越多；接近中心性表示點在復雜網絡中的價值，數值越大表明點越在中心位置；連接度則強調節點單獨的價值[18]。以介數中心性為主，接近中心性、連接度為次進行排序，見表3、圖4。

表2 益氣祛風方治療DN 的部分主要成分Tab.2 Parts of the active components of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

表3 益氣祛風方排名前20 的核心靶點拓撲信息Tab.3 Topological information of the top 20 core targets of Yiqi Qufeng Formula

圖3 益氣祛風方治療DN 潛在作用靶點的PPI 網絡圖Fig.3 PPI network of the potential targets of YQQF in the treatment of DN

圖4 益氣祛風方治療DN 核心靶點互作圖Fig.4 Interaction diagram of the core targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

圓形越大BC 越大，顏色越深CC 越大，連線越深CombineScore 越高，核心靶點以外的節點已隱藏。

3.4 核心靶點的GO 功能與KEGG 通路富集分析 將78 個核心靶點導入Metascape 數據庫進行富集分析。GO 富集分析共得到223 個BP 相關條目，包括response to hormone（對激素的反應）、protein phosphorylation（蛋白質的磷酸化）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway（跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路）、positive regulation of cell migration（細胞遷移的正向調節） 與regulation of defense response（防御反應的調節）等。74 個CC 相關條目，包括membrane raft（膜筏）、receptor complex（受體復合物）、perinuclear region of cytoplasm（細胞質的核周圍區域）等。84 個MF 相關條目，包括protein kinase activity（蛋白激酶活性）、phosphatase binding（磷酸酶結合）與protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）等，圖5 為依據P 值排序后的前15 個BP 條目與前7 個CC、MF 條目。KEGG 信號通路富集分析共獲得176 條結果，結合文獻篩選前20 條與DN 相關的通路并進行分類注釋，包括PI3K/Akt信號傳導通路/脂質及動脈硬化、糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物及受體信號傳導通路（AGE/RAGE）、趨化因子（Chemokine）信號傳導通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號傳導通路等，見圖6、7。

圖5 益氣祛風方治療DN 核心靶點的GO 富集分析圖Fig.5 GO enrichment analysis of the key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN

圖6 益氣祛風方治療DN 核心靶點的KEGG 富集通路圖Fig.6 KEGG enrichment analysis of key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN

圖7 KEGG 通路注釋圖Fig.7 KEGG pathway annotation map

3.5 益氣祛風方“主要成分-核心靶點-信號通路”網絡的構建 將上述信號通路、相關靶點及活性成分關系導入Cytoscape3.9.1，得到“核心成分-核心靶點-信號通路”網絡圖，見圖8。

3.6 主要活性成分與關鍵靶點的分子對接 用于分子對接的受體根據拓撲參數選擇核心靶點中的HSP90AA1（G3V2J8）、PIK3R1（P27986）、EP300（Q09472）、PRKCZ（Q05513）、HRAS（6Q21）、MAPK3（P27361）、IL6（P05231）、ESR1（P03372）、MAPK1（P28482）、NR3C1（P04150）和STAT3（P40763），配體即活性成分根據篩選結果及文獻選擇生松素、薺苧黃酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚體-1、N-乙酰多巴胺二聚體-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黃芪甲苷及纖細薯蕷皂苷。分子對接結果顯示，所選主要活性成分與靶點的結合能均大于-5 kcal/mol，見圖9。當配體和受體的構象穩定時，能量越低，結合的可能性越大，結合能＜0 表示可以自發結合，該值越低則結合強度越大。活性與蛋白靶點有效的結合是藥物發揮作用的前提，分子對接結果表明大部分活性成分與核心靶點具有良好的結合活性。

圖10 部分分子對接圖Fig.10 Partial molecular docking diagram

3.7 動物實驗驗證 對部分關鍵靶點如IL-6、NFκB 及關鍵通路PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路的下游效應炎性因子進行驗證。Western blotting結果顯示，模型組小鼠腎臟pNF-κB、IL-6、IL-1β、CCL5 表達量均顯著增加（P＜0．05，P＜0．001），與模型組相比，益氣祛風方組pNF-κB、IL-6、IL-1β 表達量顯著下降（P＜0．05），CCL5 表達量趨勢性下降，見圖12、13。

4 討論

DN 發病機制復雜，具體的發病機制尚未十分明確，根據目前研究進展，認為DN 的發生發展與血流動力學改變、糖脂代謝紊亂、免疫炎癥反應、細胞自噬、氧化應激及micro RNAs 等多因素相關[19]。本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術，結合網絡藥理學多平臺、多數據庫分析，探討益氣祛風方治療DN 相關的活性成分、靶點及機制。

本研究鑒定出益氣祛風方中115 個活性成分，篩選出55 個主要成分和78 個核心靶點，主要成分中包括生松素、薺苧黃酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚體-1、N-乙酰多巴胺二聚體-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黃芪甲苷及纖細薯蕷皂苷等。生松素來源于黃芪，為天然黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗菌、抗癌及神經保護作用，可通過抑制AGE-RAGE 通路進一步抑制NF-κB 活化，阻斷Caspase 3/7 和9的活化[20]，在DN 動物模型中可改善腎功能、尿蛋白及血脂譜，緩解氧化應激，減輕基底膜增厚[21]。薺苧黃酮來源于鬼箭羽，可清除自由基、抑制炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 等的釋放，降低氧化應激和炎性反應[22]。槲皮素是一種抗炎及抗纖維化的化合物，來源于黃芪、鬼箭羽，可以通過減少氧化應激、減輕炎癥、消除自由基和抑制腎小球乳頭狀細胞增生（DN 的早期病理變化之一）來延緩DN 的進展[23]。它調控PI3k/Akt 和HIF1-α 信號通路，以緩解慢性腎臟疾病或腎臟炎癥[24-25]；影響參與胰島素抵抗和2 型糖尿病發病機制的許多因素和信號通路，包括TNF-α、NF-κB、AMPK、AKT 和Nrf2[26]。N-乙酰多巴胺二聚體-1 與N-乙酰多巴胺二聚體-2 來源于蟬蛻，兩者均可有效抑制活性氧類（ROS）和一氧化氮（NO）產生，抑制NF-κB 活性以及促炎分子如誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6、TNF-α 和環氧合酶（COX）-2 的表達[27]，還可改善脂質代謝[28]。京尼平苷來源于水蛭，可有效改善DN 小鼠的腎功能，減輕基底膜增厚和炎性細胞浸潤，降低炎性因子水平，可通過調控APMK/SIRT1/NF-κB 發揮作用[14]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要藥效成分之一，在DN 動物模型中可顯著降低24 h 尿白蛋白水平，防止腎小球硬化，并通過上調nephrin 和podocin 的表達，下調乙酰肝素酶（HPSE）水平，有效地恢復腎小球濾過屏障損傷[29]；還可通過激活Rho 關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶（ROCK1）和基因功能磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）、抑制PI3K/Akt 通路來下調血管內皮生長因子（VEGF），從而抑制高糖誘導的人視網膜毛細血管內皮細胞的增殖[30]。黃芪甲苷是黃芪皂苷中的主要成分，可降低DN 大鼠尿蛋白水平，減輕足細胞及腎小管損傷，減緩DN 腎纖維化進展，可通過調控TGF-β1/PI3K/Akt 信號通路、Toll 樣受體4（TLR4）/NF-κB 信號通路、NLRP3/Caspase-1 信號通路等諸多途徑發揮作用[31]。纖細薯蕷皂苷是來源于穿山龍甾體皂苷類成分，目前研究主要關注其抗腫瘤作用，其調控自噬與凋亡主要通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路和信號轉導及轉蛋激活蛋白3（STAT3）、JAK2 等靶點[32]，與本研究中富集分析得到的核心通路、靶點一致，分子對接結果也可提供證據。

PPI 網絡分析提示本方通過以HSP90AA1、EP300 基因編碼E1A 結合蛋白P300（EP300）、PIK3R1、MAPK3、MAPK1、HRAS、IL-6、PRKCZ、雌激素受體1（ESR1）、核受體亞家族3C 組成員1（NR3C1）及STAT3 等為核心的一系列靶點起作用。HSP90AA1 基因編碼熱休克蛋白90α，是熱休克蛋白C（HSP90）的一種應激誘導型異構體，可在腎小球足細胞中表達。抑制HSP90 可以改善DM 小鼠的胰島素敏感性和高脂飲食引起的腎衰竭[33-34]；進一步可抑制NF-κB 和STAT 信號通路調節的細胞過程來改善DM 相關的腎損傷和動脈硬化[35]。EP300是賴氨酸乙酰轉移酶和基因轉錄的主要調節因子，是細胞的增殖、凋亡和分化等過程中的關鍵蛋白。EP300 基因多態性與DN 的發生發展相關，機制可能為增加缺氧誘導因子2α（HIF2α）的表達以促進腎小管上皮細胞的纖維化[36]。PIK3R1 基因編碼磷脂酰肌醇3-激酶p85α 調節亞基1 蛋白（PIK3R1），它與p110 催化亞基緊密連接，共同構成PI3K 蛋白，是AKT 信號通路中的關鍵蛋白，調節細胞存活、生長、分化、葡萄糖運輸和利用。PIK3R1 在胰島素信號傳導中起直接作用，突變可導致嚴重的胰島素抵抗[37]。MAPK3 與MAPK1 同源，兩者分別編碼絲裂原活化蛋白激酶3 和1（或稱胞外信號調節激酶2 和1，MAPK3/ERK2、MAPK1/ERK1），作為多種生化信號的整合點參與多種細胞過程，如增殖、分化、轉錄調節和發育。DN 動物模型中，ERK1/2 的異常激活可抑制足細胞及腎小管上皮細胞自噬[38]，或促使下游JNK 和P38 激活，加劇炎癥反應，導致腎纖維化[39]。PRKCZ 編碼蛋白激酶C 的ζ 型，在PI3K 和MAPK級聯中起作用，參與有絲分裂信號傳導、細胞增殖、細胞極性、炎癥反應等生理過程。胰島素信號通路中可作為PI3K 的下游效應子，并有助于激活葡萄糖轉運蛋白SLC2A4/GLUT4 的易位和葡萄糖在脂肪細胞中的轉運。該基因也與2DM 易感性相關[40]。

通路富集分析結果包含PI3K/Akt 信號傳導通路、脂質及動脈硬化、AGE/RAGE 信號傳導通路等。PI3K/AKT 信號通路具有促進細胞增殖與抑制細胞凋亡的作用，是DN 免疫炎癥機制中的一條重要信號通路，與系膜基質增生、基底膜增厚、足細胞損傷以及腎小管上皮細胞轉分化等具有密切的聯系[41]。AGEs 是高糖環境下的代謝產物，一方面直接損傷腎臟細胞和組織，另一方面與RAGE 結合形成AGE/RAGE 信號通路，可激活下游包括PI3K/AKT、MAPK/ERK 和NF-κB 等在內的多個信號通路，共同參與DN 的氧化應激、炎癥和足細胞凋亡過程[41-42]。DN 的發展和進展與血脂異常密切相關[43]，由于DM患者胰島素功能失調，血脂異常在DM 患者中很常見。由于脂質代謝過程中動脈粥樣硬化脂質化合物的增加，加劇腎臟微血管病變[44-45]，成為DN 的發生發展因素之一。本課題組前期研究已證明益氣祛風通絡法在動物模型中可以起到降低蛋白尿、減輕腎間質纖維化以及延緩腎小球硬化的作用，延緩動脈硬化效果明顯；經藥物干預后，腎組織中p-PI3K、p-AKT 水平顯著低于模型組，且通路抑制因子PTEN的表達明顯高于模型組，故其作用機制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路進而下調NF-κB、單柱細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子的表達水平有關[8]。本研究通過對益氣祛風方與DN 之間PPI 的構建與益氣祛風通絡方化合物-蛋白分子對接的研究，初步分析了益氣祛風方中黃芪、牛蒡子、穿山龍、鬼箭羽、蟬蛻、水蛭的有效活性成分，在益氣祛風方治療DN 的機制方面提供了理論依據。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法，預測出益氣祛風方中黃芪、牛蒡子、穿山龍、鬼箭羽、蟬蛻、水蛭治療DN 的潛在作用靶點和通路，并通過分子對接技術與文獻研究，得到相應的數據進行補充分析，體現了中藥多成分、多靶點協同作用于疾病的特點，為進一步探討益氣祛風方和中醫“從風論治”法的作用機制提供新思路，也為DN 的治療作用機制研究提供了新的參考和方向。