羥基紅花黃色素A 抗缺氧/復氧所致神經元損傷的作用及機制研究*

賈曉旭，張怡博，袁慶，王碩，朱金墻

（1．鄂爾多斯中醫醫院藥劑科，鄂爾多斯 017010；2．天津中醫藥大學，天津 301617；3．天津中醫藥大學中醫藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

缺血性腦血管疾病嚴重危害著人類的生命健康，及時恢復血流以實現再灌注是目前最常用的治療策略，但該策略在挽救患者生命的同時又會產生新損傷，即腦缺血再灌注損傷（CIRI）[1]。CIRI 是一種復雜的級聯反應性病理生理過程，涉及多種發病機制。研究表明，CIRI 可損傷神經元軸突及突觸結構，進一步導致海馬、大腦皮層等部位神經元死亡[2-3]。因此，神經元突觸重塑在減輕CIRI 以及神經組織修復方面發揮重要作用。

具有多環節、多靶點、多途徑等作用特點的中藥在防治CIRI 方面具有獨特的作用[4]。中藥紅花（Carthamus tinctorius L．）具有通絡活血、祛瘀止痛的功效，常用于心腦血管疾病（如高血壓病、冠心病、腦血栓）的輔助治療，其主要活性成分為水溶性成分紅花黃色素（SY），其中羥基紅花黃色素A（HSYA）為紅花黃色素中含量較高的成分[5]。藥理研究表明，HSYA 能抗興奮性毒性、抗氧化應激、抗凋亡、抗炎、保護血腦屏障和調節自噬，還能促進突觸可塑性，從而發揮抗CIRI 的作用[6-7]。Yu 等[8]研究發現HSYA 可增強大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠基底興奮性突觸傳遞，并誘導海馬長時程增強（LTP），增加腦源性神經生長因子（BDNF）和GluN2B 的表達，增強突觸可塑性，但是對CIRI 后神經元突觸重塑的作用機制尚未研究。

本研究體外原代培養皮層神經元，建立缺氧/復氧（H/R）損傷模型模擬CIRI，通過考察HSYA 對H/R 損傷后神經元活力及乳酸脫氫酶（LDH）的影響，明確其神經保護作用；并考察HSYA 對H/R 損傷的神經元中BDNF、生長相關蛋白43（GAP-43）以及NogoA mRNA 和蛋白表達的影響，初步探討HSYA抗H/R 所致神經元損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar 大鼠16 d 孕鼠，清潔級，由天津中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物與主要試劑 HSYA（天津一方科技有限責任公司，中國），DMEM/F12 培養基、B-27（GIBCO 公司，美國），胰酶1∶250（Ameresco 公司，美國），胎牛血清（FBS，HYCLONE 公司，美國），LDH 檢測試劑盒（北京中生生物工程高技術公司，中國），四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO）、多聚賴氨酸（SIGMA 公司，美國），青霉素、鏈霉素（市售分析純）、Trizol（上海生工生物技術有限公司）、逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（寶生物工程有限公司）；BDNF、GAP-43 及Nogo-A 酶聯免疫試劑盒（R&D 公司），丙三醇、氯仿、無水乙醇（分析純，天津市化學試劑廠），BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA的上、下游引物（上海生工生物技術有限公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primers Sequence

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱（THERMO，FORMA3111 型，美國），倒置相差顯微鏡（LEIClADMIL，德國），三氣培養箱（MODEL 3131，THERMO，美國），酶標儀（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美國），微量多功能讀板機（NanoQuant，infinite M200，瑞士），ABI 7300 型實時熒光定量PCR 系統（Applied Biosystems，美國）。

1.4 方法

1.4.1 神經元原代培養 參照本課題組前期實驗方法[9]，取懷孕16 d 的Wistar 大鼠，頸椎脫臼處死，用75%醫用酒精浸泡3～5 min，于無菌條件下取出胚胎大腦皮層，剔除腦膜及大血管。將皮質剪碎約1 mm3大小，加入適量0．25%胰蛋白酶，37 ℃消化5 min。立即加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12 培養液終止消化，并將組織完全吹散。經75 μm篩網過濾，收集濾液；800 r/min 離心10 min（本研究所用離心機半徑均為13 cm），棄上清，收集沉淀。用含體積分數10%FBS 的DMEM/F12 培養液將細胞重懸。調整細胞密度至1×106/mL，接種于預先涂有0．01%多聚賴氨酸的培養板中，置于培養箱培養4 h后，置換為無血清DMEM/F12 培養液（含體積分數2%B-27，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素）。以后，每2 d 半量換液1 次，細胞生長至第7 天時可用于實驗。

1.4.2 實驗分組及給藥 取接種于6 孔或者96 孔細胞培養板中的神經元，每組設平行6 孔，隨機分為正常對照組、H/R 組、羥基紅花黃色素A 低（5 μg/mL）、中（20 μg/mL）、高（80 μg/mL）劑量組，具體處理方法如下。正常對照組：置換無血清培養液繼續培養48 h，不做H/R 處理；H/R 組：置換無血清培養液，將培養板放入體積分數分別為0．94 N2、0．05 CO2、0．01 O2的三氣培養箱中缺氧孵育24 h，再于體積分數分別為0．95 空氣、0．05 CO2條件下復氧孵育24 h；HSYA 低、中、高劑量組：分別置換為含5、20、80 μg/mL HSYA 的無血清培養液，H/R 處理同H/R 組。

1.4.3 指標檢測

1.4.3.1 噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力 取接種于96 孔板的神經元，收集培養上清液（用于LDH 檢測），將MTT 液按0．5 mg/mL 的濃度加入100 μL/孔，繼續孵育4 h 后，倒置顯微鏡下可見活細胞處有大量紫藍色針狀結晶，棄上清，加DMSO 100 μL/孔溶解后，酶標儀上讀取OD 值，波長為570 nm。

1.4.3.2 LDH 試劑盒檢測細胞上清液中LDH 活性 取細胞上清液，按照試劑盒說明書方法操作，以全自動生化分析儀測定LDH 活性。

1.4.3.3 RT-PCR 檢測BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA 表達水平 取接種于6 孔板的神經元，棄培養液，用冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2 次，每孔加入1 mL 裂解液TRIzol，反復吹打，室溫放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離。加0．2 mL 氯仿，劇烈振蕩，室溫放置15～30 min 后，于4 ℃12 000 r/min離心15 min，將水相轉移到新的無RNase 的離心管中，緩慢加入1 倍體積-20 ℃保存的丙三醇，混勻，置-20 ℃2 h 以上，充分沉淀RNA。4 ℃10 000×g 離心10 min，棄上清。沉淀加入75%乙醇1 mL，重新懸浮，4℃8 000×g 離心10 min，棄上清。在超凈臺內室溫揮發5 min，加入適量無RNnase 水輕輕吹打沉淀，使之溶解，用紫外分光光度法檢測RNA 樣品的濃度及純度。反轉錄，應用ABI 7300 實時定量PCR儀分析軟件進行分析，獲得每個樣品每次反應的CT值，計算得到其△CT，進行數據統計[10]。

1.4.3.4 ELISA 檢測BDNF、GAP-43 及Nogo-A蛋白表達水平 收集各組上清液，1 000 r/min 離心10 min。將50 μL 標準品、50 μL 樣品加入相應反應孔，立即加入50 μL 的生物素標記的抗體，混勻，37 ℃溫育1 h，洗板3 次，每孔加入60 μL 的親和鏈霉素-HRP，37 ℃溫育30 min，洗板3 次，每孔加入底物A、B 各50 μL，混勻30 s，封板，37 ℃避光溫育10 min，每孔加入終止液50 μL，立即于450 nm 波長處檢測，根據標準曲線方程計算濃度。

1.5 統計學方法 運用SPSS 20．0 軟件包進行數據處理，所有數據采用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0．05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HSYA 對缺氧/復氧損傷神經元活力的影響 與正常對照組比較，H/R 組神經元活力顯著降低（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量組神經元活力均顯著增強（P＜0．01）。見圖1。

圖1 不同濃度HSYA 對缺氧/復氧損傷神經元活力的影響（±s，n=6）Fig.1 Effect of different concentrations of HSYA on neuronal viability after hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.2 HSYA 對缺氧/復氧損傷神經元LDH 釋放的影響 與正常對照組比較，H/R 組神經元LDH 釋放明顯增加（P＜0．05）。與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量組神經元LDH 釋放均顯著減少（P＜0．01）。見圖2。

圖2 不同濃度HSYA 對缺氧/復氧損傷神經元LDH 釋放的影響（±s，n=6）Fig.2 Effect of different concentrations of HSYA on LDH release in neurons with hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.3 HSYA 對H/R 損傷神經元中BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA 表達的影響 與正常對照組比較，H/R 組BDNF 及GAP-43 mRNA 表達均顯著降低（P＜0．05），Nogo-A mRNA 表達顯著增加（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量均可顯著促進BDNF mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01），且抑制Nogo-A mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高劑量可顯著促進GAP-43 mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01）。見圖3、4、5。

圖3 HSYA 對H/R 損傷神經元的BDNF mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.3 Effect of HSYA on BDNF mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖4 HSYA 對H/R 損傷神經元的GAP-43 mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.4 Effect of HSYA on GAP-43 mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖5 HSYA 對H/R 損傷神經元的Nogo-A mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.5 Effect of HSYA on Nogo-A mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

2.4 HYSA 對H/R 損傷CNC 的BDNF、GAP-43 及Nogo-A 蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，H/R 組BDNF、GAP-43 蛋白表達均顯著降低（P＜0．05），NogoA 蛋白表達水平顯著提高（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量均可顯著降低BDNF 蛋白表達水平（P＜0．05），且抑制Nogo-A 蛋白表達（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高劑量可顯著促進GAP-43 mRNA 表達（P＜0．05）。見圖6、7、8。

圖6 HYSA 對H/R 損傷神經元BDNF 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.6 Effect of HYSA on BDNF protein expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖7 HYSA 對H/R 損傷神經元GAP-43 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.7 Effect of HYSA on the expression of GAP-43 protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖8 HYSA 對H/R 損傷神經元Nogo-A 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.8 Effect of HYSA on the expression of Nogo-A protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

3 討論

CIRI 最核心的問題是神經元損害引起的神經功能障礙，因此，保護和恢復受損神經元的功能成為治療CIRI 最重要的任務[11]。近年來，諸多學者認為其治療靶點不應僅僅局限于抵抗損傷的因素，而更應該著眼于內源性的神經保護機制和長期的恢復過程[12]。

神經營養因子可誘導、調節和控制神經元的生存、生長、遷移以及與其他細胞建立功能性聯系，并在神經再生過程中促進軸突的再生長。神經營養因子（NTFs）是一類對神經元的發育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質，主要分為：1）神經營養素（NT）家族，包括神經生長因子（NGF）、BDNF、神經營養因子-3（NT-3）、神經營養因子-4/5（NT-4/5）等。2）膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）。3）睫狀神經營養因子（CNTF）。這些蛋白質已經成為治療神經損傷等疾病的潛在藥物標靶。其中BDNF 是體內含量最多的神經營養因子。BDNF 是從豬腦脊液中發現的一種具有神經營養作用的堿性蛋白質，BDNF 及其受體在神經系統廣泛表達，但主要是在中樞神經系統內表達，其中海馬和皮質的含量最高。它通過與酪氨酸激酶受體B（TrkB）的結合而發揮作用，對神經元的生存、分化、生長和神經元正常生理功能具有維持和促進作用，而且還有增加突觸可塑性及神經再生等作用[13]。本研究結果顯示，HSYA 可有效抑制H/R 引起的LDH 釋放，明顯增加神經元細胞活力，表明HSYA 能有效減輕H/R 引起的神經元損傷。為了探究其作用機制，本研究進一步考察了HSYA 對神經元表達及分泌BDNF 的影響，結果表明HSYA 可有效促進神經元釋放BDNF。

此外，BDNF 還可以促進突觸成熟，增加突觸可塑性[14-15]。因此，本研究進一步考察HSYA 是否可以通過促進BDNF 表達而增加神經元突觸可塑性。GAP-43 是存在于神經元軸突生長錐中的一種特異性胞膜磷酸蛋白，廣泛分布于大腦、小腦、脊髓、背根節以及自主神經系統的神經元內。在發育中的神經元內，沿整個軸突表達，在生長錐表達尤其豐富；而在成熟神經系統，主要分布于某些特定區域的神經終末中，在促進神經細胞生長、軸突再生和突觸重構等方面發揮重要作用，已成為研究神經生長發育和損傷修復等神經可塑性的首選分子探針[16-17]。Nogo-A 是一種氨基酸的膜蛋白，是有效的軸突生長抑制因子，不僅表達于少突膠質細胞，還廣泛表達于神經元，是反映神經損傷后是否可再生的指標之一[18-19]。在生理狀態下，Nogo-A 對生長較遲的神經纖維起到約束的作用，神經纖維只能進入特定的區域層內。在成年哺乳動物中樞神經系統中，Nogo-A的主要作用是保持中樞神經系統微環境的穩定，防止不必要的出芽，有助于保持神經聯系的特異性，防止形成不必要的、錯誤的投射，通過微管動力學調節參與軸突生長和樹突塑形的進程。Nogo-A 與其他生長抑制因子和神經生長促進因子呈平衡狀態，當出現外界刺激后，其內部平衡被破壞，Nogo-A呈現抑制作用[20-21]。以上兩種蛋白均可一定程度地分泌到細胞外。本研究考察了HSYA 對神經元內GAP-43 和Nogo-A mRNA 以及細胞上清液中二者蛋白含量的影響，結果顯示，HSYA 可促進GAP-43 mRNA 及蛋白表達，同時抑制Nogo-A mRNA 及蛋白表達，表明HSYA 能有效增加神經元突觸可塑性。

本研究初步表明HSYA 抗H/R 損傷神經元的作用機制可能是通過促進BDNF 表達而改善神經元生存狀態，并增加神經元突觸可塑性。但該作用還有待從神經元突觸微觀形態學角度來進一步驗證，其作用機制亦有待圍繞BDNF/酪氨酸激酶B（TrkB）、Nogo-A/Nogo-A 受體（NgR）等信號通路進行深入探討。