雙條拂粉蚧基因組DNA提取方法的比較和優(yōu)化

王宇航，孟秀利，黃山春，林兆威，宋薇薇，唐慶華，覃偉權(quán)

（1. 海南大學 植物保護學院，海口，570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 椰子研究所/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南 文昌，571339）

雙條拂粉蚧（Ferrisia virgataCockerell）屬半翅目（Hemiptera）、粉蚧科（Pseudococcidae）昆蟲，刺吸式口器。該蟲以寄生植物，吸食植物葉片或果實的汁液存活，其適應(yīng)性較強。雙條拂粉蚧作為一種重要的熱帶農(nóng)林害蟲在世界上分布和寄主植物都非常廣泛，并且雙條拂粉蚧還是可可腫枝病毒（Cacao swollen shoot virus，CSSV）和檳榔黃葉病毒病1（Areca palm velarivirus 1，APV1）等病毒病的傳播媒介昆蟲[1-2]。該蟲還是一種進境水果檢疫性粉蚧[3]。鑒于雙條拂粉蚧昆蟲在傳播病原方面的多樣性及其對熱帶作物的危害性，研究該蟲基因組DNA提取優(yōu)化方法，可以在分子實驗基礎(chǔ)上建立后續(xù)的昆蟲防治[3]等方面的研究，也可為后續(xù)研究雙條拂粉蚧作為檳榔黃化病媒介昆蟲的病原檢測提供高質(zhì)量DNA。

植原體（Phytoplasma）是一種主要通過媒介昆蟲傳播、存在于植物韌皮部及媒介昆蟲的腸道、淋巴及唾液腺等組織內(nèi)的原核生物[4-6]。近年來，隨著植原體對世界范圍內(nèi)對許多經(jīng)濟作物造成的嚴重減產(chǎn)，對植原體病害也進行了更廣泛的拓展研究[7]。目前中國是發(fā)現(xiàn)植原體病害最多的國家，至今已報道100多種植原體病害，由植原體侵染引起的病害如棗瘋病、甘蔗白葉病、檳榔黃化病等[8]可造成嚴重的經(jīng)濟損失。在海南，植原體侵染引起的檳榔黃化病（Areca palm yellow leaf disease，YLD）是一種毀滅性病害，每年因該病造成的經(jīng)濟損失高達20億以上[9]。

本研究團隊在檳榔黃化病媒介昆蟲的研究中，前期發(fā)現(xiàn)雙條拂粉蚧體內(nèi)攜帶植原體，推斷該蟲可能為檳榔黃化病的媒介昆蟲，但想要更細致研究媒介昆蟲的單頭蟲接種以及如何使病原分子檢測更精確，在采集昆蟲樣本進行基因組DNA提取時，防止DNA降解以及如何從體型微小的單個蟲體提取足量的DNA是至關(guān)重要的[10]。為了獲得高質(zhì)量的雙條拂粉蚧基因組DNA，提高植原體的檢出率，本研究采用3種研磨方法與2種試劑盒進行組合，對不同數(shù)量和不同保存時間的雙條拂粉蚧進行了基因組DNA提取實驗，確定最優(yōu)能夠獲取提取單頭雙條拂粉蚧昆蟲高濃度基因組的提取方法，為后續(xù)媒介昆蟲的驗證實驗提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用蟲 所需實驗用蟲是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所植物保護中心飼養(yǎng)的雙條拂粉蚧3齡成蟲。當天采集的活體雙條拂粉蚧（A處理）和經(jīng)95%酒精浸泡并在-20 ℃冰箱保存7 d后的雙條拂粉蚧（B處理）用于DNA提取試驗。

1.2 試劑盒及實驗器材 TIANGEN血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（貨號DP304-03，TIANGEN，中國，以下簡稱TIANGEN試劑盒）、QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit（貨號69506，QIAGEN，德國，以下簡稱QIAGEN試劑盒）2種試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。用于組織研磨的Servicebio KZ-III-F型高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，金屬研磨杵同樣購自天根生化科技（北京）有限公司，不銹鋼鋼珠（直徑5 mm）購自鼎特爾鋼球有限公司。超微量紫外光分光光度儀（Q5000型，Quawell，美國）購自上海洪紀儀器設(shè)備有限公司。

1.3 不同保存時間和數(shù)量的蚧蟲基因組DNA提取方法 以雙條拂粉蚧3齡成蟲為實驗材料，分別采用TIANGEN、QIAGEN 2種試劑盒進行基因組DNA提取。每種試劑盒分別采用研磨杵單獨研磨、研磨儀單獨研磨、研磨儀+研磨杵3種方法進行提取前研磨。各組合如下：（1）研磨杵+QIAGEN試劑盒；（2）研磨儀+QIAGEN試劑盒；（3）研磨杵+研磨儀+QIAGEN試劑盒；（4）研磨杵+TIANGEN試劑盒；（5）研磨儀+TIANGEN試劑盒；（6）研磨杵+研磨儀+TIANGEN試劑盒。將當天采集（A處理）和預處理（B處理，用滅菌水將經(jīng)95%酒精浸泡的昆蟲沖洗3次，用吸水紙吸干昆蟲體表的水）后的1、3、5、7和10頭雙條拂粉蚧放入滅菌2.0 mL離心管中；QIAGEN試劑盒先加入裂解液ATL和蛋白激酶K、TIANGEN試劑盒先加入裂解液GA和蛋白激酶K。研磨杵手動研磨后按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。研磨方法換為研磨儀，則在放有粉蚧的離心管中加入2粒直徑為5 mm的鋼珠，放入研磨儀研磨，參數(shù)設(shè)置為60 s/120 Hz，研磨2次。研磨后再進行DNA提取。研磨方法為研磨杵+研磨儀，先將離心管中的粉蚧用研磨杵手動研磨，再在離心管中加入2粒鋼珠，放入研磨儀（60Hz，120s）研磨，2次研磨后按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的DNA于-20 ℃保存。

1.4 DNA電泳 將5 μL樣品DNA與1 μL溴酚藍混合進行點樣，分子量標記采用Marker 2000。電泳用1%瓊脂糖凝膠，1 × TAE電泳緩沖液，電壓120 V，室溫30～40 min，凝膠成像系統(tǒng)獲取凝膠圖譜進行分析。

1.5 實驗數(shù)據(jù)分析 所有實驗數(shù)據(jù)用微量紫外分光光度儀測定提取基因組DNA的OD值和濃度值。采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計軟件正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用平均值±標準差（Mean ± SD）表示，進行單因素方差分析，P＜0.05與P＜0.01分別表示差異顯著與極顯著。使用Adobe Photoshop 2022（V23.5.1）進行實驗電泳照片的編輯處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種提取方法下不同數(shù)量和保存時間的蚧蟲DNA濃度比較 6種提取方法下不同數(shù)量和保存時間的蚧蟲DNA濃度比較結(jié)果（表1、表2）表明，雙條拂粉蚧材料無論是A處理還是B處理均可完成基因組DNA的提取。在2種試劑盒中，TIANGEN試劑盒在使用研磨杵和研磨儀研磨蟲體后提取的DNA濃度更高（P＜0.05），尤其是用1或3頭成蟲進行提取，例如用1頭粉蚧進行提取，TIANGEN試劑盒搭配研磨杵+研磨儀獲得的濃度是QIAGEN試劑盒相同條件下的1.2倍～1.5倍。本實驗數(shù)據(jù)還顯示，2種試劑盒均呈現(xiàn)隨粉蚧數(shù)量增加獲得的DNA濃度逐漸升高的趨勢，在10頭昆蟲提取時獲得的DNA最高，2種不同處理下3組樣品平均值分別為185.43、148.23 ng·μL-1。B處理提取的基因組DNA濃度不如A處理，所以建議在采集雙條拂粉蚧樣品后盡量當天進行基因組提起以獲得相對高濃度的DNA，如不能當日提取也可酒精浸泡保存，并盡量在雙條拂粉蚧提取時選擇多頭數(shù)提取。

表1 6種方法提取當天采集蚧蟲基因組DNA濃度（A處理）

表2 6種方法提取經(jīng)95%酒精浸泡7 d后蚧蟲基因組DNA濃度（B處理）

2.2 6種提取方法下不同數(shù)量和保存時間蚧蟲DNA質(zhì)量比較 對A處理當天采集的雙條拂粉蚧進行基因組DNA提取，然后測定OD值。根據(jù)2種試劑盒的說明書，提取的基因組DNA樣品的A260/A280通常在1.9左右代表樣品基因組DNA提取質(zhì)量比較高，蛋白質(zhì)、酚類及多糖雜質(zhì)去除的比較完全。OD值如果大于正常范圍則表示提取的DNA樣品中有RNA污染；小于正常范圍說明含有少量蛋白質(zhì)及酚類物[11]。表3和表4顯示，TianGen研磨杵+研磨儀法整蟲提取法在A處理和B處理雙條拂粉蚧提取基因組DNA的OD值遠優(yōu)于其他方法，OD值均為1.80～1.95。能提出較好的基因組DNA質(zhì)量。其他方法組提取的OD值均為1.95～2.20，OD值大都偏高說明DNA含有雜質(zhì)。

表3 6種方法提取當天采集蚧蟲基因組DNA純度（A處理）

表4 6種方法提取經(jīng)95%酒精浸泡7 d后蚧蟲基因組DNA純度（B處理）

2.3 6種提取方法DNA電泳圖的比較 選用了2種適用于昆蟲基因組DNA提取的試劑盒及3種不同研磨方法提取雙條拂粉蚧的基因組DNA，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA完整性。電泳后條帶清晰明亮，說明DNA提取方法較好、濃度和純度相對較高[12]。凝膠電泳結(jié)果（圖1）表明，不同提取方法對DNA完整性影響不同，6種方法獲得的DNA均有一定程度的降解。A處理（當天采集雙條拂粉蚧）6種方法提取樣品DNA均在2 000 bp以上區(qū)域有明顯條帶（圖1-Ⅰ）。B處理(20 ℃中經(jīng)95%酒精浸泡7 d后)QIAGEN試劑盒法和使用研磨杵的TIANGEN試劑盒法所提DNA電泳無明顯條帶、條帶亮度較弱（圖1-Ⅱ），這表明保存7 d后的蚧蟲基因組DNA會降解并且這幾種方法提取的DNA產(chǎn)率不高。總體來看，使用研磨儀+研磨杵+TIANGEN試劑盒法所提DNA完整性最好，跑膠條帶最為清晰。

圖1 雙條拂粉蚧基因組DNA電泳圖

3 討 論

本實驗以B處理的20℃冷藏用95%酒精浸泡7 d后的雙條拂粉蚧作為實驗材料，在數(shù)量較少時（1或3頭），基因組DNA的濃度較低，其OD值與A處理當天采集昆蟲樣品提取的基因組DNAOD值相差不大，這表明酒精保存并沒有對基因組DNA的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。但用單頭粉蚧進行提取時，無論用哪種研磨方法或試劑盒，提取的DNA濃度均低于A處理當天采集的粉蚧樣品提取的DNA。因此，采集的粉蚧樣品若當天或2 d內(nèi)無法進行DNA提取時，不建議用酒精冷凍保存過長時間，因為這可能對后續(xù)PCR擴增（如蟲體內(nèi)植原體檢測）產(chǎn)生一定影響。

近年來試劑盒法在各實驗領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，試劑盒提取方法也在不斷優(yōu)化更新，其目的都是利用優(yōu)化的試劑盒法更快速、簡便、高效地提取基因組DNA。因此，對于粉蚧類小型昆蟲，基因組DNA提取多采用高效快速的試劑盒法[13-15]，試劑盒法在提取昆蟲時對樣品的蟲數(shù)要求較少，且不需要其他特殊的試劑和實驗器材，簡單、省時，大大提高了對樣品基因組的提取效率。近年來，不同實驗室使用試劑盒法進行DNA提取與純化中的應(yīng)用越來越多。例如，黃鳳蘭等[16]使用優(yōu)化條件后的試劑盒法，通過對提取過程中處理條件優(yōu)化，優(yōu)化后提取出的基因組DNA質(zhì)量更高。何衍彪等[17]和陳哲等[18]用DNA抽提試劑盒法成功提取扶桑綿粉蚧和12種粉蚧的基因組DNA，并且試劑盒法提取的基因組DNA質(zhì)量能很好地支持后續(xù)的分子鑒定、基因序列比較等實驗。周夢月等[19]在幾種提取方法比較實驗中發(fā)現(xiàn)使用試劑盒法所得DNA進行PCR擴增的成功率最高。在試劑盒法的優(yōu)化DNA提取過程中，多是采用裂解條件、裂解時間[20]、洗脫液的用量等優(yōu)化方法。在實驗前處理的研磨方法上研究較少，本實驗在研磨方法上提出改良，也為后續(xù)研究其他DNA提取方法優(yōu)化提供參考。

昆蟲基因組DNA提取的關(guān)鍵步驟之一是對實驗用蟲蟲體的破碎，常用的就是研磨杵、研磨儀、液氮研磨等研磨方法。對于雙條拂粉蚧這種小型昆蟲的破碎，筆者在前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在用液氮研磨時，由于昆蟲較小，在研缽中研磨后昆蟲組織并不易收集。但若單用研磨杵研磨雙條拂粉蚧，因為蟲體柔軟沒有太堅硬外骨骼，研磨時由于蟲體翻滾使得研磨杵不便于著力，導致短時間較難將整蟲研磨好，但長時間研磨可能會導致基因組降解。所以本實驗最終選擇的研磨杵+研磨儀的雙研磨方式既解決了昆蟲組織不易收集的問題, 又使得基因組不在長時間研磨后被自身的核酸酶降解。

本研究結(jié)果為后續(xù)進行檳榔黃化病區(qū)采集的雙條拂粉蚧樣品進行病原植原體檢測（尤其是田間粉蚧數(shù)量較少情況下樣品的檢測）以及帶“毒”雙條拂粉蚧接種驗證等研究奠定了基礎(chǔ)。