基于GC-MS代謝組學分析MK-801誘導精神分裂癥大鼠血漿代謝特征

黃云霞 黃雪霞 文靜

精神分裂癥是一種嚴重而復雜的精神障礙，全球發病率約為1%［1］，主要表現為陰性癥狀、陽性癥狀及認知缺陷等［2-5］。精神分裂癥多發于青春期且發病機制十分復雜，目前尚未完全闡明其發病機制。地佐西平（dizocilpine，MK-801）是一種N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）非競爭性拮抗劑，國內外廣泛用于誘導精神分裂癥的動物模型的工具藥［6-8］。然而，其誘導精神分裂癥癥狀的機制也尚不完全清楚。代謝組學是研究內源性代謝物的方法，通過識別正常或病理代謝變化及相關的生化途徑，挖掘分子機制和發現生物標志物，為探索疾病機制提供新的研究思路［9-10］。因此，本研究采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）的非靶向代謝組學方法，探討MK-801誘導精神分裂癥的大鼠血漿顯著代謝物影響及相關代謝途徑，為進一步探明精神分裂癥的發病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠20只，選購于北京維通利華實驗動物技術有限公司；許可證編號：SCXK（京）2020-0005。飼養環境為：室溫20 ～24 ℃，相對濕度15% ～ 55%，實驗動物自由飲食，自然光照，通風良好。

1.1.2 藥物與試劑 MK-801（德國Sigma公司，77086-22-7），L-2-氯苯丙氨酸（98%）（北京百靈威科技有限公司），硬脂酸甲酯（99.5%）（美國 Sigma-Aldrich 公司），甲氧胺鹽酸鹽（99%）（北京百靈威科技有限公司），BSTFA+1%TMCS （98%）（北京Solarbio科技有限公司），乙腈（色譜純）（美國Thermo Fisher 公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設備 氣相色譜-質譜聯用儀7890A-5975C（美國Agilent公司）；冷凍研磨儀 JXFSTPRP-CL（上海凈信實業發展有限公司）；高速冷凍離心機STR16R（美國Thermo Fisher 公司）；十萬分之一電子天平 BSA124S-CW（德國Startorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及行為學測試 20只雄性SD大鼠分為對照組（腹腔注射生理鹽水，n=10）和試驗組（腹腔注射MK-801制備精神分裂癥大鼠模型，0.5 mg∕kg，n=10）［11］，每天上午9點給藥1次，連續給藥2周。最后一次給藥后24 h依次參照文獻方法［12-13］進行曠場（open field test，OFT）、高架十字迷宮（elevated plusmaze test，EPM）和新物體識別實驗（novel object recognition test，NOR）對精神分裂樣癥狀進行評價。OFT觀察指標為總路程反映大鼠自主運動量（即中樞神經系統的狀態興奮或抑制）。EPM觀察指標為大鼠進入開臂次數和在開臂停留時間（在開放臂的活動多少），用于評價大鼠的焦慮狀態。NOR測試包括兩個試驗熟悉期（T1，探索兩個相同物體）和測試期（T2，更換一個物體為新物體），通過識別新舊物體的時間評價大鼠的學習記憶能力。

1.2.2 溶液配制 準確稱取 L-2-氯苯丙氨酸適量，配制成濃度約為 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液作為內標1。準確稱取甲氧胺鹽酸鹽適量，配制成濃度約20 mg∕mL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液作為肟化試劑。準確稱取硬脂酸甲酯適量配制成濃度約為 50 μg∕mL硬脂酸甲酯正庚烷工作液作為內標2。配制好的溶液均保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 血漿樣品的制備 SD大鼠麻醉后，采集大鼠心血（約 0.5 mL）置于有肝素鈉（12 500單位）離心管并離心，取澄清血漿于凍存管中保存。取樣后迅速將樣本置于液氮中，待全部取樣完成后轉移至-80 ℃冰箱中保持。

1.2.4 血漿樣本的預處理 分別從兩組7個解凍血漿樣本中移取血漿約100 μL置于1.5 mL離心管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混勻，加冰乙腈300 μL渦旋混勻，離心取上清液100 μL氮氣揮干。于殘渣中加 30 μL濃度為 20 mg∕mL 的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，渦旋15 s后于 80 ℃烘箱中肟化 15 min，放冷后加 50 μL濃度為 50 μg∕mL 的硬脂酸甲酯庚烷溶液，渦旋，高速離心取上清 90 μL置于進樣小瓶。

質控樣本：取所有血漿樣本各30 μL于5 mL EP管中混勻，制得質控（quality control，QC）樣本。根據樣本數量計算所需要質控樣本數量，需要5個質控樣本。取血漿質控樣本100 μL于1.5 mL EP管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混勻。加冰乙腈300 μL，其余操作同血漿樣本。對照樣本：取 100 μL冰乙腈于 1.5 mL EP管中，加入 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液 20 μL，其余操作同血漿樣本。

1.2.5 CG-MS 儀器條件

1.2.5.1 色譜條件 DB-5MS型號毛細色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純He氣流速：1.0 mL∕min；進樣口溫度：250 ℃；輔助加熱器溫度：230 ℃；進樣方式：不分流進樣；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持1 min，8 ℃∕min升至300 ℃，最后保持7 min，進樣程序需38 min。質譜條件四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子轟擊電離（electron impact， EI）方式，電離能量70 eV，溶劑延遲4.5 min，全掃描模式（SCAN），掃描范圍M∕Z 50～600 amu。

1.2.5.2 進樣條件 自動進樣器進樣，進樣體積 2 μL，檢測樣本前先進行內標、空白以及 QC 樣本進樣（連續3個）。在整個分析檢測過程中，每進7個樣本安插進1個 QC樣本。內標用于確定色譜峰的位置，空白用于排除外源性物質干擾，QC 用于考察 GC-MS 分析檢測過程中的穩定性。

1.2.6 血漿代謝物篩選 血漿樣本經過前處理及GC-MS分析后，色譜圖經過 AMDIS 6.51 軟件及NIST14 數據庫（安捷倫科技，美國）進行去卷積及色譜峰識別，匹配度＞80%的色譜峰為可定性代謝物，導出數據至 EXCEL，色譜信息包含化合物名稱、保留時間及峰面積。

將用于定性的所有代謝物的峰面積均除以 L-2-氯苯丙氨酸（內標 1）的峰面積得到代謝物的相對濃度，同時刪除 QC 樣本中相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大于 30%的物質，將剩余部分的數據處理成矩陣的形式。

1.2.7 血漿差異代謝物篩選 數據導入Metaboanalyst 4.0 數據庫中進行多元統計分析。首先采用主成分分析法（principal components analysis，PCA）分析，觀察包括 QC 在內的各組間區分度及組內聚集情況，初步評價實驗的組內和組間差異是否明顯，并通過 QC 樣本的聚集情況判斷樣本分析的總體質量。然后通過偏最小二乘法-判別式分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）分析MK-801組與對照組之間的效果，根據變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP），VIP 值大于 1，t檢驗P值小于0.05 篩選差異代謝物。

1.2.8 血漿差異代謝物通路分析 將上述統計學分析篩選出的差異代謝物導入Metaboanalyst 4.0數據庫的“通路分析”模塊進行通路分析。通路分析參數：通路數據庫為Rattus Norvegicus（rat）；通路富集分析算法為超幾何檢驗（hypergeometric test）；拓撲分析算法為相對中介中心性（relative-betweeness centrality）。通路分析結果中，P值小于0.05的通路認定為顯著改變的代謝通路。

3 結果

3.1 行為學檢測 OFT實驗結果顯示，與對照組相比，試驗組大鼠運動距離顯著降低（圖1A）。EPM實驗結果顯示，試驗組大鼠在進入開臂的次數和在開臂持續的時間較對照組顯著降低（圖1B、1C）。NOR實驗結果顯示，在熟悉期（T1）對照組和試驗組大鼠對兩個相同物體探索時間均無顯著差異；在測試期（T2）對照組大鼠對新物體探索時間較熟悉物體顯著增加（P＜0.05），而試驗組大鼠對新物體探索時間較熟悉物體沒有顯著差異。見表1。以上結果提示，試驗組大鼠精神分裂癥模型制備成功。

表1 新物體識別實驗頭部探索時間統計（）

表1 新物體識別實驗頭部探索時間統計（）

注：與大鼠識別熟悉物體時間相比，對照組和試驗組大鼠識別新物體的時間，①P＜0.05。物體1和2為兩個相同物體。

測試物體1物體2 F值P值熟悉期（T1）（s）對照組10.65±3.63 9.89±4.83 1.457 0.7719試驗組5.82±6.35 3.79±4.57 1.931 0.575試驗組5.99±4.18 8.17±4.16 1.009 0.4288測試熟悉物體新物體F值P值測試期 （T2） （s）對照組7.01±10.15 33.53±16.97①2.796 0.0134

圖1 OFT和EPM實驗

3.2 血漿代謝物篩選結果 與NIST14譜庫比對，匹配度＞80%為定性標準，分別在QC樣本中定性出80種代謝物。見圖2。

圖2 血漿樣本GC-MS總離子色譜圖

3.3 血漿差異代謝物篩選結果 PCA分析結果如圖3A所示，對照組與試驗組有部分重合，QC樣本聚集較好。PLS-DA分析顯示，兩組樣本能有效區分（圖3B）。交叉驗證模型變量結果R2=0.864 72，Q2=0.775 38。以VIP 值大于1和t檢驗P值小于0.05為標準篩選差異代謝物結果見表2，試驗組與對照組相比共篩出10種差異代謝物，其濃度變化均呈下降趨勢。

表2 血漿樣本差異代謝物

圖3 兩組樣本PCA和PLS-DA得分圖

3.4 血漿差異代謝物的通路分析 差異代謝物代謝通路分析結果見表3。血漿差異代謝物主要參與氨酰-tRNA生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝。即苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酸參與氨酰-tRNA生物合成代謝通路；苯丙氨酸、酪氨酸參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝。

表3 血漿代謝通路信息表

4 討論

精神分裂癥是一種嚴重的精神疾病，發病機制復雜，已經成為全球衛生資源的沉重負擔。然而，精神分裂癥的病因和機制仍未闡明。精神分裂癥研究公認的藥理模型是NMDA受體的非競爭性拮抗劑（MK-801和氯胺酮），因此本研究參照文獻［11］方法采用MK-801給藥，模擬大鼠的精神分裂癥樣行為，構建了精神分裂癥的大鼠模型。通過代謝組學的技術探索MK-801誘導類似精神分裂癥模型大鼠體內內源小分子的代謝，挖掘與精神分裂癥相關的特征性生物標志物及代謝途徑，為精神分裂癥病理提供新的見解。

自主活動、焦慮及認知障礙是精神分裂癥的典型癥狀，分別用曠場、高架十字迷宮和新物體識別試驗進行評價。在OFT中，與對照組相比，試驗組大鼠自主運動顯著降低。在EPM測試中，試驗組大鼠進入開臂次數和在開臂持續的時間較對照組顯著減少，表明MK-801慢性給藥誘導大鼠焦慮樣行為。NOR試驗中模型大鼠識別能力較對照組顯著降低，表明認知障礙。這與一項以MK-801構建精神分裂為模型進行治療藥物機制研究中的結果一致［14］。上述行為學結果表明采用MK-801給藥成功構建實驗性精神分裂癥大鼠模型。

生物體代謝組的改變往往是受基因、疾病、環境、藥毒物等多因素作用后的最末端反應，可以為尋找表型變化的“線索”［15］。本實驗采用基于GC-MS的代謝組學檢測方法對亞慢性MK-801給藥后大鼠血漿樣本進行檢測，PCA分析結果顯示QC樣本聚集較好，提示GC-MS在樣品分析過程中較為穩定，系統誤差小；對照組與試驗組有部分重合說明兩組存在一定代謝物差異。PLS-DA分析結合交叉驗證結果表明該模型可靠、擬合準確性好。經過差異代謝物篩選，試驗組多種氨基酸濃度較對照組顯著降低，包括蘇氨酸、絲氨酸、肌氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸、酪氨酸和色氨酸，其濃度均顯著下降。提示MK-801誘導的精神分裂癥可能導致血漿氨基酸代謝紊亂。

氨基酸是三羧酸循環的前體，影響蛋白質合成和能量代謝［16］。氨基酸代謝異常與多種神經精神障礙有關，包括自閉癥譜系障礙［17］、智力殘疾、癲癇［18］和精神分裂癥［19］等。如谷氨酸和D-絲氨酸水平與抑郁癥、精神分裂癥和認知缺陷的嚴重程度呈負相關［20-22］，其中，谷氨酸能缺陷被認為是精神分裂癥中常見的許多癥狀的基礎，特別是陰性和認知癥狀。研究表明，谷氨酸和D-絲氨酸均是NMDAR激動劑，可以改變NMDAR的功能。而NMDAR對神經興奮性傳遞、突觸可塑性、學習和記憶［23］至關重要，NMDAR功能減退是精神分裂癥的一個重要病因成分［21］。此外，氨基酸對于蛋白質合成、能量代謝和神經傳遞等代謝過程至關重要。本研究結果顯示，MK-801引起大鼠血漿谷氨酸和絲氨酸水平的下降，表明MK-801擾亂二者體內代謝的穩態，進而影響NMDAR甘氨酸位點的底物代謝，導致NMDAR功能障礙，這與人類慢性精神分裂癥患者中發現谷氨酸合成全面下調結果一致［24］。精神分裂癥是復雜行為和精神心理的綜合狀態，可能與多條代謝通路有關。本研究發現了部分差異代謝物，并篩選出主要參與的相關代謝通路，其中顯著改變的絲氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等可能成為與精神分裂癥相關的潛在生物標志物，下一步將利用靶向代謝組學進行深入研究，希望能為精神分裂癥相關機制的研究提供更進一步的基礎。