富血小板血漿及其復合銀離子的體外抑菌效果研究

劉勝杰 馬武秀 陳聰聰 張淦 吳旅 陳肖松

難愈性創面指無法通過正常、有序、及時的修復過程恢復解剖和功能上完整狀態的創面［1］，易引發細菌感染。由于局部血供受損，靜脈藥物治療難以到達損傷部位，創面局部外用治療方案較靜脈藥物治療更為直接和有效。富血小板血漿（plateletrich plasma，PRP）富含加速創面修復的血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、類胰島素生長因子（insulin-like growth factor，IGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等生長因子［2］。Cetinkaya等［3］研究表明，PRP有一定的體外抑菌效果，但各文獻對于PRP的抑菌譜及抑菌效果尚無明確定論。銀離子作為臨床較為常用的體外抗菌材料，具有滅菌效率高、不易誘發細菌耐藥等優點［4］。因不具備生物活性，銀離子對難愈性創面修復的治療效果有限。本研究旨在觀察PRP及其復合銀離子后對臨床常見細菌的抑菌效果，以及銀離子對復合物中PRP釋放生長因子能力的影響，為臨床治療難愈性創面提供新的更加高效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 金黃色葡萄球菌標準株（編號ATCC25923）、大腸埃希菌標準株（編號ATCC25922）、銅綠假單胞菌標準株（編號ATCC27853），實驗菌株由中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院檢驗科提供。

1.2 實驗材料及儀器 硝酸銀固體（Sigma-Aldrich）、一次性注射器（1 mL、5 mL，江蘇蘇云）、營養瓊脂培養基平板（90 mm，環凱微生物）、高精度電子天平（安徽中科中佳）、立式壓力蒸汽滅菌器（登冠醫療） 、麥氏比濁儀（梅里埃）、電熱恒溫培養箱（上海力康）、PRP制備套裝（山東威高） 、高速離心機（山東威高）、全自動血細胞分析儀（邁瑞BC-3000）、ELISA試劑盒（南京森貝伽）、全自動酶免儀（深圳愛康Uranus AE280）等。

1.3 菌種培養及保存 在無菌操作臺對實驗菌種進行復蘇、轉種并37℃培養24 h。用一次性接種環挑取培養24 h的3種細菌置于緩沖液中，校正濁度為0.5麥氏單位，備用。

1.4 富血小板血漿的制備 血樣采自10名健康志愿者（年齡20～32歲），威高PRP套裝中采血管空腹采集每名志愿者肘部靜脈血52 mL后，取2 mL血樣測血小板濃度均處于正常范圍，剩余50 mL對稱置入高速離心機，制備PRP。

1.5 硝酸銀溶液的制備 電子天平秤取硝酸銀固體10 mg，置入1 000 mL圓底燒瓶后加入少量無菌水，用玻璃棒攪拌，使其溶解。繼續添加無菌水至1 000 mL刻度線，根據最佳抑菌濃度，制成銀離子濃度為10 ppm的硝酸銀溶液。將制備完成的硝酸銀溶液移入棕色玻璃瓶保存。

1.6 分組 抑菌實驗：根據抑菌材料分為對照組（1 mL PBS緩沖液）、PRP組（1 mL PRP）、銀離子組（1 mL硝酸銀溶液）、復合組（0.5 mL PRP+0.5 mL硝酸銀溶液），各組每種細菌分別涂布4個平板（共計48板）。生長因子檢測：為避免復合銀離子后樣本稀釋對生長因子濃度測定的影響，樣本分為無干擾PRP組（1 mLPRP+1 mL PBS緩沖液）、PRP+銀離子組（1 mL PRP+1 mL銀離子溶液），每組標本各10份，重復測量3次，取平均值。

1.7 抑菌實驗及觀察指標 用1 mL一次性注射器分別抽取0.1 mL金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及大腸埃希菌菌懸液，均勻涂布在瓊脂平板上。再用5 mL注射器抽取每組所需抑菌材料，依次均勻涂布在帶菌平板上。涂布完成的平板放入37℃恒溫培養箱，分別于12 h、18 h、24 h、36 h以及48 h后觀察平板細菌生長情況并記錄結果。無細菌或少量細菌生長記為“-”；1∕4板記為“+”；1∕2板記為“2+”；3∕4板記為“3+”；滿板記為“4+”。

1.8 生長因子測定 取PDGF、TGF-β、VEGF試劑盒，按照試劑盒檢測說明書配制好所有試劑。兩組標本按照試劑盒說明書所要求完成實驗操作。在450 nm波長下使全自動酶免儀測定，并制作相應標準曲線，計算生長因子濃度。

1.9 統計學方法 采用SPASS 26.0進行統計分析，正態分布計量資料用表示，兩組間均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 制備PRP樣本數據 健康志愿者全血中血小板計數為（187.0±21.0）×109∕L，白細胞計數（7.5±0.9）×109∕L；制備成PRP后，血小板計數為（955.0±112.0）×109∕L。

2.2 金黃色葡萄球菌抑菌實驗結果 37℃條件下，培養12 h后，對照組、PRP組出現細菌生長及滿板，18 h之后兩組所有平板細菌生長情況均為滿板。培養12 h、18 h后，銀離子及復合組未見明顯細菌生長，24 h后，兩組出現細菌生長，36 h后仍未出現滿板情況，在48小時所有平板細菌生長情況均為滿板。見表1，圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌培養基生長情況

表1 各組對金黃色葡萄球菌的抑菌效果對比

2.3 大腸埃希菌抑菌實驗結果 37℃條件下，培養12 h后，對照組、PRP組出現細菌生長，18 h后兩組細菌生長出現滿板，24 h之后均為滿板。培養12 h、18 h及24 h后，銀離子及復合組未見明顯細菌生長，在36 h，兩組出現細菌生長，至48 h仍未出現滿板情況。見表2，圖2。

圖2 大腸埃希菌培養基生長情況

2.4 銅綠假單胞菌抑菌實驗結果 37℃條件下，培養12 h后，對照組、PRP組出現細菌生長，18 h兩組出現滿板，24 h之后兩組細菌生長情況均為滿板。培養12 h、18 h后，銀離子及復合組未見明顯細菌生長，24 h后，兩組出現細菌生長，36 h未出現滿板情況，在48 h所有平板細菌生長均為滿板。見表3，圖3。

圖3 各組對銅綠假單胞菌抑菌效果

表3 各組對銅綠假單胞菌的抑菌效果對比

2.5 PRP及PRP復合銀離子后生長因子檢測結果銀離子與PRP復合后所檢測到的PDGF、TGF-β、EGF以及VEGF生長因子濃度均小于PRP組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 兩組生長因子濃度比較(，ng/L)

表4 兩組生長因子濃度比較(，ng/L)

注：PRP為富血小板血漿, PDGF為血小板衍生因子,TGF-β為轉化生長因子-β,EGF為表皮生長因子,VEGF為血管內皮生長因子。

組別PRP組復合組t值P值VEGF 1 081.15±21.63 1 079.00±13.83 0.265 0.794樣本量（個）10 10 PDGF 316.12±3.08 315.16±3.19-0.689 0.499 TGF-β 3 060.00±18.93 3 051.98±19.44 0.935 0.362 EGF 4 670.61±30.05 4 658.75±62.10 0.544 0.593

3 討論

PRP是一種血液濃縮制成的具有生物活性的物質，富含遠高于循環血液濃度的血小板［5］。一方面，PRP可釋放對高濃度組織再生和修復至關重要的PDGF、TGF-β、EGF、VEGF等，調節免疫系統，觸發組織的細胞再生過程［6］；另一方面，血漿為再生提供了纖維蛋白支架，并在創面愈合過程中維持增殖和氧化穩態［7］。因此，PRP生物活性主要應用在促進組織修復以及創面愈合方面，而其應用效果主要與釋放生長因子的濃度密切相關。同時，國內外文獻報導PRP對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌等具有一定的抑菌作用［8-9］，但對于同一種細菌，不同的文獻甚至出現有效和無效兩種截然不同的結論［10-11］，其抑菌作用尚有爭議。本研究通過體外抑菌試驗探究PRP的抑菌效果，結果顯示單純PRP的體外抑菌試驗在12 h內即出現細菌生長及滿板，與對照組相比未表現出明顯的抑菌效果。

為達到更穩定的抑菌效果，武鈺翔［12］將莫西沙星負載于富白細胞-血小板纖維蛋白（leukocyte-rich platelet fibrin，L-PRF）中進行體外抑菌實驗。因為PRP中含有大量的纖維蛋白，為細胞的生長提供良好支架的同時，還為復合各類協同材料提供了結構基礎［13］：與單純L-PRF未表現出明顯的抑菌效果相比，負載莫西沙星后的L-PRF對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌具有明確的抑菌作用。但是隨著抗生素在臨床的大量使用，細菌的耐藥問題愈發嚴重，負載抗生素增強抑菌效果無法滿足臨床需要，亟需一種新的抑菌材料加以復合。

銀離子作為一種抗菌材料或者物質，其主要通過干擾細胞壁的合成、損傷細胞膜、抑制蛋白質的合成、干擾核酸的合成等途徑達到抑菌效果。銀離子可與細胞質膜相互作用，破壞電子轉移和質子驅動力，使其失活；銀離子還可與膜內巰基（-SH）、氨基（-NH2）等含硫、氨的官能團反應，破壞細胞合成酶活性，最終導致細胞死亡。此外，暴露在空氣或水中的銀離子能夠激活其中的氧，產生活性氧離子（O2-），破壞細菌繁殖能力，達到抗菌效果［14］；同時因為不易產生耐藥性，銀離子被廣泛應用于各種抗菌敷料中［15］，在創面感染的防治中發揮重要作用。孫建斐等［16］利用體外細胞毒性噻唑藍法對不同濃度銀離子溶液的細胞毒性進行檢測，結果顯示，濃度達到10 ppm的銀離子溶液即具有極強的抑菌效果，濃度超過12.5 ppm其細胞毒性才會明顯增加，當銀離子濃度低于12.5 ppm時對細胞不會產生損害。因此本研究采用PRP復合10 ppm濃度的銀離子溶液進行體外抑菌實驗。

在生物安全性方面，硝酸銀早在1965年就被用于燒傷創面的局部治療［17］。陳炯等［18］在臨床研究中發現，與對照組相比，患者在應用銀敷料后的第3～5天血清銀及尿銀水平有所升高，但在14天后恢復至正常，患者的肝腎功能無損害，且電鏡觀察創面組織未發現銀沉積現象。另有文獻提出，當銀離子與完整的皮膚接觸時不會造成人體血液中銀離子含量增加，銀離子也不會對眼睛和皮膚造成刺激［19］。

本次體外抑菌試驗證明，在36 h內，銀離子對臨床常見的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌均有良好的抑菌效果，最長抑菌時間可達48 h。但由于其作為化學材料的局限性，銀離子僅能通過殺滅細菌、防止細菌在創面定植產生細菌生物膜，消除創面愈合的不利因素，改善愈合環境，從而達到間接促進創面愈合的作用。對整個創面愈合過程而言，銀離子并不直接參與組織修復，因此其對難愈型創面的治療效果有限。

探究PRP與銀離子復合后的抑菌效果以及其對PRP釋放生長因子能力的影響，可為臨床對難愈性創面的治療提供新思路。本研究結果顯示，相較于對照組，PRP復合銀離子后表現出良好的抑菌效果，在24 h內，3種細菌均未見明顯生長，其中復合物對大腸埃希菌的抑菌作用在48 h后仍未消失，證明其對大腸埃希菌具有更好的抗菌效應，且與單純銀離子組相比，兩組的體外抑菌結果未表現出明顯差異。

目前雖已有關于PRP的抗菌試驗，但都是針對單一菌種，本實驗針對的菌種較多，可橫向分析銀離子及其復合PRP抑菌效果。同時少有PRP聯合其他材料的體外抑菌研究，更無聯合銀離子的體外抑菌試驗。其原因可能出于對銀離子或許會干擾PRP本身生長因子釋放的顧慮，為驗證銀離子復合PRP后對其生物活性的影響，本研究進行了相關生長因子濃度檢測。

在對單純PRP組以及復合組PDGF、TGF-β、EGF、VEGF的濃度檢測中，復合組4種生長因子濃度均小于單純PRP組，但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究證實了PRP與銀離子復合后，銀離子對PRP釋放生長因子的能力無明顯負面影響。宋瑞捧等［20］在生長因子復合含銀敷料治療感染創面的臨床研究中表明，銀離子不會對生長因子的生物活性產生影響，且不會造成銀中毒。

綜上所述，PRP復合銀離子對臨床常見的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌皆具有明確的抑菌作用，同時銀離子對PRP中生長因子的釋放無明顯影響。本研究證實了PRP與銀離子復合的可行性：兩者的復合物在充分利用PRP的組織再生修復作用的同時，亦能發揮銀離子的抗菌效應。參照臨床對于感染性難愈型創面的隔日換藥治療方法，PRP與銀離子復合后的36 h抗菌時長能夠滿足治療需要，為臨床治療伴隨感染的難愈型創面提供可行的方法與思路。本研究仍存在一些不足：復合組PRP與銀離子本次的比例為1∶1，后續可采用其他比例復合，探究兩者復合的最適比例；實驗僅為體外抑菌試驗，對于真實創面的效果未知，有待進一步研究確認，但本實驗結果可為后期動物試驗提供一定參考。