酶底物法檢測地表水中糞大腸菌群的時間因素探索

周熙 吳夢青 何羽 周玉芳 鞏宏平

（1.杭州市余杭生態環境監測站，浙江杭州 311199；2.杭州市臨平生態環境監測站，浙江杭州 311199；3.浙江省生態環境監測中心，浙江杭州 310012）

1 引言

與傳統的多管發酵法［1］、濾膜法［2］測定水中的糞大腸菌群相比，酶底物法因操作環境要求低、方法簡便且檢測結果無顯著性差異，將是未來實驗室的主要應用方向［3］。酶底物法檢測糞大腸菌群的原理是在特定溫度下培養特定的時間，產生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基苯酚（ONP），統計陽性反應出現數量后查MPN 表，計算出樣品中糞大腸菌群的濃度值［4］。隨著HJ 1001—2018《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》的實施，酶底物法檢測水中糞大腸菌群的基本方法已經確定，本文在此基礎上對一些重要因素進行探索。

查閱已有研究，溫度和培養時間對檢測結果有顯著影響，而使用無菌水或實驗室純水，環境因素和培養方式對檢測結果的影響不明顯［5-6］。HJ 1001—2018 中要求測定糞大腸菌群時，將封口后的97 孔定量盤放入恒溫培養箱中44.5±0.5 ℃下培養24 h。本文探討培養時間、97 孔定量盤冷藏保存時間這兩方面對實際操作有影響的時間因素及季節的影響（一年中不同月份地表水中糞大腸菌群波動情況）。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

遠藤氏培養基；Colilert 大腸菌群/大腸桿菌檢測試劑；Quanti-Tray 97 孔定量盤；Colilert 97 孔陽性比色盤；恒溫培養箱；97 孔定量盤封塑設備。

2.2 樣品來源

樣品來源于杭州市余杭區地表水（河流水及水庫水）。

2.3 水樣采集

用采水器或其他滅菌器采集水樣放入滅菌瓶內。

2.4 方法

除設定條件外，測定按照HJ 1001—2018 中的規定操作。

3 結果與分析

3.1 培養時間的影響

雖然培養時間24 h 已經比傳統的初發酵24 h+復發酵24 h 節約了一半時間，但在實際工作中如果能進一步縮短或延長時間，仍然有其現實意義。有研究指出，酶底物法檢測總大腸菌群培養溫度控制在35～37 ℃的情況下，培養時間在22～28 h 之間可以得到準確結果，而大腸埃希氏菌的檢測則需24～28 h［5］。表1 中將地表水樣品分別稀釋1，10，100 倍，以對應不同河流水庫中高中低濃度的樣品，稀釋用水和空白樣用水均為無菌水。

表1 糞大腸菌群97 孔定量盤陽性格數時間變化

從表1 中可以看出，高濃度未稀釋樣品在24 h內97 孔定量盤會全黃，通過平時大量的觀察，這一時間從數小時到二十幾小時不等。對于考核指標等于或嚴于GB 3838—2002《地表水環境質量標準》中Ⅳ類水（糞大腸菌群低于20 000 個/L）的水體，可以不稀釋，并在培養時間小于24 h 發現定量盤全黃時，結束培養，得出定性結論。定量盤非全黃的樣品在培養時間超過24 h 后，仍會有少量孔變黃，因此24 h 為標準規定時間，而非ONPG 分解全部完成時間。

3.2 定量盤冷藏保存時間的影響

在結束培養后需立即讀取定量盤變化孔數，否則隨著時間的延長，變黃孔數很可能繼續增加，尤其是夏季高溫環境下總大腸菌導致的變黃孔數增多。如果不能及時讀數或者需要事后檢查確認，是否可以將定量盤冷藏保存一段時間，本節對此進行探討。圖1 是完成培養當天、冷藏3 d 后、冷藏7 d 后的定量盤照片，變黃孔數沒有明顯變化。因此，結束培養后，如不能及時讀數，可將定量盤冷藏保存一段時間再讀數，不過如有個別臨界狀態的孔還是應該盡早讀數。穩妥起見，可以在培養結束后對定量盤拍照，與同一位置的標準陽性比色盤照片對比讀數，照片還可以留存備案。

圖1 結束培養后定量盤冷藏時間變化

3.3 季節的影響

一年中不同季節地表水的糞大腸菌群是否存在規律性波動，是否會有季節的明顯區別，本節將對此進行探討。圖2 是杭州市余杭區5 個斷面（瓶窯水廠取水口、奉口、徑山水廠取水口、仁和水廠取水口、閑林水庫）2022 年糞大腸菌群均值（MPN/L）的變化趨勢，可以看出較熱月份（6 月、9 月）糞大腸菌群出現高值的可能性會高于其他季節，這應該和水中微生物活性增強有關，而最熱的7 月、8 月糞大腸菌群數值不高，應該與氣溫過熱有關。

圖2 杭州市余杭區5 個斷面2022 年糞大腸菌群均值

4 結論

（1）酶底物法檢測糞大腸菌群，在定性要求嚴于Ⅳ類水的情況下，發現定量盤全黃即可結束培養，不必等到24 h。

（2）結束培養后，如不能及時讀數，可將定量盤冷藏保存一段時間再讀數，或拍照與標準陽性比色盤照片對比讀數。

（3）較熱月份糞大腸菌群出現高值的可能性會高于其他月份。