宏基因組二代測序在肺部感染合并呼吸衰竭中的應用*

張瑩瑩 劉 斌

安徽醫科大學附屬阜陽人民醫院呼吸與危重癥醫學,安徽省阜陽市 236011

肺部感染是呼吸系統的常見臨床疾病,是死亡的主要原因之一[1]。肺部感染合并呼吸衰竭使患者面臨多病原體復合感染的風險,嚴重情況下發展為敗血癥或多器官衰竭,導致28d的死亡率很高,這對患者和醫院來說是一個負擔,不僅增加醫療費用,同時也增加患者住院時間[2-3]。因此控制肺部感染是治療重要部分,但最初不合理治療,使發病率和死亡率明顯升高[4]。因此,根據病原體培養結果快速識別致病微生物并對抗菌藥物進行調整,對急性和復雜感染非常重要。

檢測呼吸道病原體的傳統方法包括微生物學培養、形態學檢查(涂片)、血清學檢測等,然而,所有這些方法都有其缺點,如靈敏度低、耗時長等[5]。有研究發現,傳統培養中高達60%未能檢測出明確病原體[6]。隨著技術發展,宏基因組二代測序(mNGS)應運而生,mNGS是一種檢測樣品中所有核酸的方法,包括對核酸片段進行擴增和精確測序,并與已知的參考片段進行比較、定位和整合,利用計算機算法獲得目標核酸的完整序列,可以快速、高效和準確地直接檢測臨床樣本中的基因組信息,全面鑒定細菌、病毒、真菌、寄生蟲,在診斷效能方面優于傳統檢測[7]。目前對于mNGS在肺部感染合并呼吸衰竭方面相關研究缺乏,而在臨床上病原學診斷對這類群體具有重要的意義。故本文旨在討論mNGS對于肺部感染并發呼吸衰竭患者病原學診斷及臨床治療等價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年1月—2023年2月本院呼吸與危重癥醫學科收治肺部感染合并呼吸衰竭患者89例。這一研究符合本院倫理委員會的要求,患者在接受纖維支氣管鏡檢查前均于檢查同意書上簽字。倫理批件號:醫倫理審查[2022]14號。

1.2 納入與排除標準 (1)納入標準:年齡≥18歲,男女不限;肺部感染、呼吸衰竭的診斷標準遵循《內科學》第9版[8]。(2)排除標準:①標本不合格者;②妊娠或哺乳期女性;③資料不全者。

1.3 資料收集 收集入選患者的傳統培養及mNGS結果、抗生素使用情況、生化、C反應蛋白等血檢。

1.4 傳統病原體檢測方法 本院行呼吸道病原體核酸檢測(PCR-熒光探針法)、微生物的涂片、培養等,標本來源包括痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等。

1.5 mNGS檢測 mNGS 檢驗由天津金匙科技有限公司進行DNA 測序。首先將標本進行核酸提取,并對DNA質量進行評估,然后將構建的文庫在Illumina測序儀器上檢測,最后經過低質量序列過濾、人源序列去除等生物信息分析之后進行報告解讀。mNGS 標本大部分來源于肺泡灌洗液,采樣根據2017年《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識》[9],由于小部分患者無法進行支氣管鏡灌洗,進行痰液、胸腔積液、血液取樣。

1.6 病原體判斷 確定病原體[10],可包括以下任何一條:(1)傳統檢測確定的陽性病原體與mNGS確定的陽性病原體一致;(2)傳統檢測或mNGS確定的陽性病原體與患者的臨床癥狀或治療反應相同;(3)如果mNGS和傳統檢測檢出不同,需與病原體致病的文獻證據相一致。

1.7 分組標準 將肺部感染合并呼吸衰竭患者的宏基因檢驗數據與傳統檢驗數據分為2組,分別為mNGS組與傳統檢測組。

1.8 統計學方法 統計分析采用 SPSS26.0 軟件。正態分布的計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗或校正后的t檢驗,偏態分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數資料以率(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗、McNemar檢驗或Fisher 精確檢驗。以P<0.05定義差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mNGS和傳統微生物檢測結果比較 mNGS檢測的陽性率為93.26%(83/89),高于傳統微生物檢測的69.66%(62/89),差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

2.2 mNGS和傳統病原體培養檢測(真菌+細菌培養)結果比較 在89例感染性患者中,均執行病原體培養檢測及mNGS檢測的共計81例,其中57例為傳統病原學培養陽性(70.37%),行mNGS陽性77例(95.06%),兩者的差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

2.3 mNGS和病原體核酸PCR檢測結果比較 89例病例中有64例同時行病原體PCR檢測及mNGS,其中PCR檢測陽性31例(48.44%),mNGS陽性58例(90.63%),經檢驗兩者差異有顯著統計學意義(P<0.05)。

2.4 mNGS與傳統方法效能比較 入組的89例患者,根據病原學檢測及臨床綜合分析來分組,確定病原體組有80例,非確定病原體組有9例,見表1。mNGS與傳統病原學檢測靈敏度分別為98.75%(95%CI 92.27～99.93)、57.50%(95%CI 45.95～68.32),差異有統計學意義(P<0.05),特異度分別為55.56%(95%CI 22.65～84.66)、77.78%(95%CI 40.19～96.05),無統計學差異(P>0.05)。mNGS與傳統病原學檢測的陽性預測值(PPV)分別為95.18%(95%CI 87.45～98.44)、95.83%(95%CI 84.57～99.28),陰性預測值(NPV)83.33%(95%CI 36.48～99.12)、17.07%(95%CI 7.70～32.65)。

表1 mNGS與傳統檢測結果分布

2.5 發展為重癥肺炎患者感染情況 納入研究的89例患者中,有80例確定病原學,其中發展為重癥肺炎的患者38例,未發展重癥肺炎的患者42例。重癥組患者病情更為嚴重,住院時長較久,具有較高的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞比率,較低的淋巴細胞計數、血小板,較高水平的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐,監護室住院時長較久,均較非重癥組有顯著性差異(P<0.05)。兩組感染類型中可見,發展為重癥肺炎患者單純感染、混合感染、細菌病毒真菌混合感染較未發展為重癥肺炎患者有統計學差異(P<0.05),感染類型分布見表2。

表2 重癥組與非重癥組感染類型分布[n(%)]

2.6 疾病轉歸情況 根據患者病原學檢出情況、臨床癥狀、輔助檢查進行分析,判斷病原微生物,并依此調整抗生素治療。80例患者確定病原體,44例調整了抗生素應用,其中重癥組24例,非重癥組20例。兩組的好轉率差異有統計學意義(P<0.05),但病死率差異無統計學意義。見表3。

表3 兩組患者疾病轉歸情況[n(%)]

3 討論

肺部感染導致肺組織病變,肺部炎性滲出增多,引起通氣功能障礙,此外,肺實質破壞導致氣體彌散功能下降,最終引起呼吸衰竭,嚴重者各臟器功能損傷,甚至死亡。因此,對于肺部感染合并呼吸衰竭的患者,除給予呼吸支持外,盡早明確病原菌感染情況并采取針對性的抗感染治療措施非常關鍵。事實證明,二代測序在診斷感染方面有很大的臨床價值,并在一些指南和共識文件中被推薦[11-13]。本研究探討mNGS 在肺部感染合并呼吸衰竭患者中的病原學診斷及對臨床診療策略影響等方面的應用價值。此研究收集了在我院呼吸科住院并行mNGS檢查的89例肺部感染合并呼吸衰竭患者,系統地比較了mNGS和傳統病原學檢測的檢驗結果。

本研究mNGS與傳統檢測方法進行了對比,結果顯示mNGS檢測的陽性率高于傳統微生物檢測,差異有統計學意義(P<0.01)。mNGS與傳統病原體培養檢測、病原體核酸PCR檢測結果比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。綜上,從傳統微生物檢測、傳統病原體培養檢測、病原體PCR檢測比較,mNGS診斷優于以上檢測項目。Wang J等[14]研究結果顯示,mNGS在肺部混合感染中檢出率高于傳統方法,本研究結果與其一致。對于肺部感染合并低氧性呼吸衰竭需要早期精準抗感染治療,因此mNGS檢測非常重要,特別對于常規檢測陽性率不高的病原體,如隱球菌、肺孢子菌等。對于一些復雜感染需要更大范圍的病原篩查,而mNGS對此有一定指導作用。

Ying Li等[15]研究顯示,在細菌診斷方面,mNGS對比培養法靈敏度及特異度分別為88.89%及74.07%,mNGS對比涂片法的靈敏度及特異度是100%及77.78%。Duan H等[16]研究發現,mNGS的靈敏度高于傳統檢測(67.4%VS 23.6%,P<0.05),而在特異度方面未見統計學差異(68.8%VS 81.3%,P>0.05)。本研究與上述研究結果相符合,mNGS靈敏度較傳統病原學檢測高,且具有統計學差異,而在特異度方面無統計學差異,這可能與入院前已使用抗生素等因素,一些病原體培養難度大有關[17]。在一些體液樣本中,游離DNA很少,由于mNGS靈敏度較高,即使在微量核酸下mNGS也能獲得大量數據,檢出覆蓋面廣的微生物,為臨床病原菌參考提供了有力證據。但是其特異度低,在報告中可能看到不致病病原體、不相關病原體,這些也與標本污染等原因有關,且不易鑒別,這需要質控對比后進行排除。因此,為明確診斷,還需聯合傳統檢測技術,以協助對疾病致病菌的判斷。

有研究表明在社區獲得性肺炎患者中,混合性感染類型多見的是兩種細菌感染或一種細菌感染與一種非典型病原體感染[18-19],重癥肺炎中呼吸道病毒感染較常見,混合病毒—細菌感染增加死亡風險[20]。本研究數據發現,在發展重癥肺炎與未發展重癥肺炎患者相比,單純感染、混合性感染有統計學差異(P=0.015、0.007),在混合性感染中感染類型為細菌、真菌、病毒的混合感染有統計學差異(P=0.028),表明混合感染較單一感染嚴重程度高,發展為重癥肺炎可能性大,在10例細菌病毒真菌混合感染患者中,病死率為60%(6/10),提醒臨床醫生在重視此類感染的患者,在明確相關病原體后盡量早期合理應用抗生素,降低患者的死亡率。在一些基礎疾病多,起病急,病情重,經驗性抗感染治療效果不佳,提示可能為少見病原學感染,應用mNGS檢測快速篩查病原體,可早期靶向治療干預,使患者得到積極有效治療,阻止病情惡化。

本研究調整抗生素的患者有44例,重癥組24例,非重癥組20例。該兩組的好轉率差異有統計學意義(P<0.05),而病死率差異無統計學意義(P>0.05),考慮重癥組部分患者病情惡化,家屬要求自動出院,未予以納入死亡例數的計算中有關。

mNGS應用廣泛,但有一定局限,其本身測序讀長的上限,影響一些遺傳信息解析,且結果缺乏一致的判定標準。本研究也存在不足:(1)本文樣本量較少,引起實驗結果的偏差,結果需通過增加樣本量進一步驗證。(2)本研究中進行的mNGS檢測均為DNA檢測,未進行RNA檢測,可能存在病原學結果與實際不符的情況。(3)樣本送至外地實驗室,這增加了樣品污染和樣品核酸降解風險。

mNGS給臨床提供了大量病原體信息,在報告中有些病原學測序濃度低或序列數不高,難以作為金標準,也只是有提示意義。對于傳統方法難以檢測的微生物如厚壁結核菌、孢子菌等,mNGS陽性結果有較大意義。當然,臨床醫師不能單純依靠檢測手段來確定病原菌,應注重結合流行病學、不同類型患者等情況來進行綜合評估,比如呼吸機相關性肺炎其常見病原菌類型與醫院獲得性肺炎相似,但病原譜分布有一定差別,且耐藥率也不同,這些情況都需要醫師考慮到。

綜上,mNGS較傳統培養檢測病原菌陽性率更高,整體優于傳統檢測,根據mNGS檢測病原體結果指導抗感染方案可以提高治療效果,對指導臨床具有重要價值。雖然mNGS價格昂貴,在臨床應用中仍有一定的局限性,但在嚴重感染,疑難病例中,可將mNGS作為傳統方法的補充,以促進精準醫學的開展。