LINC01140在肝膽胰癌中的低表達及其靶向功能預測*

杜秀芳 李建棣 顏詩白 李建軍 黃志廣 黨裔武 陳 罡 危丹明

1 廣西醫科大學第一附屬醫院病理科,廣西南寧市 530021; 2 廣西醫科大學第二附屬醫院普通外科

癌癥是中國及世界范圍內的主要公共衛生問題之一,中國癌癥的發生率和死亡率一直上升,已成為頭號死亡原因[1]。而肝膽胰惡性腫瘤占據主要位置,盡管醫療診治水平逐漸提高,但其死亡率仍居前列,預后極差[2]。盡管肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌及膽管癌已經有相應的診斷相關標志物,但其敏感性和特異性相對較差。隨著對肝膽胰惡性腫瘤的深入研究,越來越多的基因調控和信號通路等分子機制被揭示,尋找新的診斷、預后標志物及治療靶點亟待進行。

隨著轉錄組測序和全基因組技術的深入發展,越來越多的長鏈非編碼RNA(lncRNA)被發現,并成為腫瘤研究的重要領域。lncRNA是長度從200個核苷酸到100個堿基的非編碼RNA,不同的RNA之間存在相互作用,lncRNA 通過控制基因表達參與了一系列與癌癥相關的生物學過程[3-5]。目前有部分文獻報道了LINC01140在非小細胞肺癌、骨肉瘤、轉移性肉瘤、腦膠質瘤及乳腺癌中的表達情況及作用機制。然而不同報道,LINC01140的調控作用尚有差異,如在非小細胞肺癌、骨肉瘤、轉移性肉瘤及乳腺癌中發揮抑癌作用,在腦膠質瘤及肺癌中發揮癌基因的作用,促進癌癥的發生發展。然而在消化系統惡性腫瘤中LINC01140的差異表達及其作用差異表達miRNAs的靶向mRNAs預測未見報道。而膽囊、肝外膽管系統、肝及胰均起自胚胎第4周出現的中腸肝憩室[6],具有一定的相關聯系。本研究旨在研究分析肝膽胰惡性腫瘤(肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌、膽管癌)中LINC01140的表達及作用機制,為預后的生物標志物或有效的治療靶點提供依據。

1 材料和方法

1.1 肝膽胰癌中基因微陣列及高通量測序數據獲取及分析 從GEO、TCGA-GTEx、SRA、ArrayExpress數據庫及PubMed、Web of Science、中國知網、維普、萬方數據庫中檢索肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌、膽管癌轉錄組數據。納入數據集滿足以下條件:(1)人原發性肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌、膽管癌組織(若為miRNAs芯片也可納入體液樣本);(2)樣本量≥6。剔除重復樣本及缺乏對照的數據集。對納入數據集進行平臺合并、批次效應移除、數據標準化處理。所得矩陣即平臺表達矩陣。

1.2 預后分析 為評估LINC01140在肝膽胰癌患者中的預后性能,從Kaplan-Meier Plotter中收集肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌及膽管癌隊列研究預后資料(包含免疫治療隊列),分析LINC01140表達對患者總體生存期(Overall survival,OS)的影響。以LINC01140中位表達值為界,將患者分為LINC01140高表達組、LINC01140低表達組,利用Kaplan-Meier生存分析評估兩組間預后差異。

1.3 差異表達分析 分別利用上述移除批次效應后平臺表達矩陣進行基因差異表達分析。肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌及膽管癌差異表達mRNAs或差異表達miRNAs需滿足以下條件:(1)標準化平均差(Standardized mean difference,SMD)絕對值>0;(2)P值<0.05。

1.4 LINC01140靶向miRNAs預測分析 根據RNA相互作用百科全書在線預測LINC01140作用miRNAs。通過繪制韋恩圖對差異表達miRNAs及LINC01140靶向miRNAs進行交集。對LINC01140作用差異表達miRNAs的靶向mRNAs進行預測。

1.5 基因交集分析 鑒于miRNAs發揮功能得益于其基因調控作用,本研究通過繪制韋恩圖對肝細胞癌、胰腺導管腺癌、膽囊癌及膽管癌高表達基因、LINC01140作用miRNAs的靶向mRNAs進行交集。對LINC01140、LINC01140作用差異表達miRNAs及其靶向mRNAs構建ceRNA調控網絡。

1.6 基因功能注釋 對“基因交集分析”中的交集基因進行基因本體(Gene Ontology,GO)—生物過程(Biological process,BP)、GO-細胞成分(Cellular component,CC)、GO-分子功能(Molecular function,MF)功能注釋,同時利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集初步分析肝膽胰癌中LINC01140-miRNA-mRNA調控軸的潛在分子生物學機制。

1.7 統計學方法 在R、STATA統計軟件中進行數據分析。從上述批次后平臺表達矩陣提取LINC01140表達值,計算其例數、均數和標準差,用隨機效應模型計算其合并的SMD值。利用Egger檢驗、漏斗圖評估發表偏倚。通過進行亞組分析和敏感性分析探尋異質性來源。繪制受試者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲線及匯總受試者工作特征(summary ROC,sROC)曲線,計算其曲線下面積(Area under the curve,AUC)、評估LINC01140對肝膽胰癌的區別能力,<0.7、0.7～<0.9、≥0.9分別提示區別能力較弱、中等、較強。計算敏感度、特異度、陽性似然比及陰性似然比。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC01140在肝膽胰癌組織中低表達 本研究基于平臺數據集,整合分析2 215例肝膽胰癌及1 679例周圍正常組織對照樣本中的LINC01140表達量,可見LINC01140在肝膽胰癌中低表達(P<0.01),其標準化均數差(SMD)值為-0.47[-0.76,-0.18],差異具有統計學意義(見圖1a)。經漏斗圖分析未見明顯發表偏倚(見圖1b)。整合分析結果可靠,計算sROC曲線AUC為0.64[0.60,0.68](見圖1c),似然比、陽性似然比、陰性似然比森林圖結果提示LINC01140用于區分肝膽胰癌的準確性欠佳(見圖1d、圖2)。

圖1 LINC01140在肝膽胰癌組織中顯著低表達

圖2 LINC01140低表達對肝膽胰癌組織的區分能力

2.2 LINC01140低表達在肝膽胰癌組織中的亞組分析 LINC01140肝膽胰癌中低表達(P<0.01),對其進行亞組分析,分別肝細胞癌、膽囊癌及膽管癌、胰腺導管腺癌中低表達(見圖3)。其中在肝細胞癌中低表達(P<0.01),其SMD值為-0.60 [-1.06,-0.14],差異具有統計學意義,計算sROC 曲線AUC 為 0.80 [0.76,0.83],見圖4a;在膽囊癌及膽管癌中低表達(P<0.01),其SMD值為-0.75[-1.59,0.09],差異具有統計學意義, 計算sROC 曲線AUC 為 0.91 [0.88,0.93] ,見圖4b;在胰腺導管腺癌中低表達(P=0.16),其SMD值為-0.08 [-0.25,0.08],具有低表達趨勢, 計算sROC 曲線AUC 為 0.60[0.55,0.64],見圖4c。

圖3 LINC01140低表達在肝膽胰癌組織中的亞組分析

圖4 INC01140低表達區分肝膽胰癌組織的sROC曲線a.肝細胞癌 b.膽管癌及膽囊癌 c.胰腺癌

2.3 LINC01140低表達在免疫治療隊列中的預后價值 基于LINC01140表達的肝膽胰癌患者Kaplan-Meier生存曲線,低表達患者總生存期明顯低于高表達患者[HR=0.61(0.52～0.73),P<0.001,見圖5a],無進展生存期明顯低于高表達患者[HR=0.57(0.45～0.72),P<0.001,見圖5b],LINC01140低表達提示預后較差。

圖5 LINC01140低表達在免疫治療隊列中的預后價值a.總體生存期 b.無進展生存期

2.4 探索肝膽胰癌LINC01140-miRNA-mRNA調控網絡 經過基因表達差異分析發現LINC01140作用的差異表達miRNAs 54個,肝細胞癌中差異表達miRNAs 499個,胰腺癌中差異表達miRNAs 397個,其中hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-382-3p、 hsa-miR-452-5p及hsa-miR-4677-3p參與肝膽胰癌中LINC01140調控網絡(見圖6a、b)。取肝膽胰癌高表達基因與LINC01140作用miRNAs的靶向mRNAs交集,預測LINC01140作用差異表達miRNAs的靶向mRNAs 273個(見圖6c)。

圖6 LINC01140 ceRNA交集分析a.LINC01140作用的差異表達miRNAs b.LINC01140作用miRNAs統計 c.肝膽胰癌高表達基因、LINC01140作用miRNAs靶向mRNAs交集

2.5 LINC01140-miRNA-mRNA調控軸GO富集分析及KEGG富集分析 LINC01140參與的ceRNA GO功能富集分析結果(見圖7a)顯示主要參與的生物過程(Biological processes, BP)包括細胞器組織的正向調節、有絲分裂細胞周期及細胞成分生物發生的正向調節等,同時細胞成分(Cell component,CC)主要富集在黏著斑、細胞—基質連接及紡錘體等,而分子功能(Molecular function,MF)富集結果主要集中在泛素樣蛋白連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合及鈣粘蛋白結合等。KEGG功能富集分析結果顯示,根據富集程度排在前三位的信號通路分別為Salmonella infection、Focal adhesion及Hippo signaling pathway(見圖7b)。

圖7 LINC01140 ceRNA在肝膽胰癌中的潛在分子機制a.GO分類 b.KEGG通路

3 討論

消化道惡性腫瘤肝細胞癌、膽囊癌及膽管癌、胰腺導管腺癌早期起病隱匿,不易被發現,病情進展快,以手術切除為主要治療手段,然而通常晚期治療效果不佳,患者預后差。盡管肝細胞癌的分子和免疫治療已建立標準治療方案,早期射頻、中期肝動脈化療栓塞術、晚期分子治療占據主導位置,但其治療效果仍然不佳[7]。晚期膽道癌一線治療的標準參考方案仍為吉西他濱聯合順鉑,然而免疫治療也具有一定的局限性[8]。雖然輔助治療可以為肝膽癌出現癥狀的晚期疾病患者提供較好的結果,但常規輔助化療和放射治療的作用機制尚不清楚[9]。胰腺導管腺癌以預后極差而著稱,且難以早期發現,通常錯過了最佳手術時期,然而即使當腫瘤被及早發現時,成功切除的患者,預后仍然嚴峻,估計中位總生存期(OS)不到23個月[10]。手術切除往往與化療和(或)放射治療相結合,然而這些方法能適度改善總體存活率,但它們對大多數人來說根本不是治愈的[11]。因此迫切需要探索治療肝膽胰癌的治療靶點及預后標志物。

近年來,有文獻報道LINC01140在腫瘤組織中的調控作用及其機制。然而在尚未報道LINC01140在肝膽胰癌中的生物學作用及調控機制。本研究基于平臺數據集,整合分析2 215例肝膽胰癌及1 679例周圍正常組織對照樣本中的LINC01140表達量,證實了LINC01140在肝膽胰癌中低表達,納入的樣本量更大、面更廣,對研究LINC01140表達的臨床意義有極大的補充。

相關研究發現LINC01140在轉移性肉瘤中的表達較低,預示著肉瘤的總體生存率、無病生存率和疾病特異性生存率較低[12]。LINC01140在乳腺癌患者腫瘤組織中低表達,低表達患者預后不良[13]。這些研究表明LINC01140分別在轉移性肉瘤及乳腺癌中可能發揮抑癌作用,且低表達還提示預后不良。本研究中,基于LINC01140表達的肝膽胰癌患者Kaplan-Meier生存曲線分析,低表達患者總生存期明顯低于高表達患者,無進展生存期明顯低于高表達患者,LINC01140低表達提示預后較差。同時推測LINC01140調控的hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-452-5p及hsa-miR-4677-3p參與肝膽胰癌中LINC01140調控網絡。hsa-miR-199a-3p是與肝癌相關的關鍵miRNAs,顯著上調,且上調的核心調控通路與肝細胞癌通路相關[14-15]。相關研究表明,LINC01140調控網絡在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用,如非小細胞肺癌中LINC01140表達下調,通過海綿作用miR-4742-5p正向調節TACC1的表達[16]。LINC01140下調通過靶向miR-139-5p/HOXA9軸,抑制骨肉瘤細胞的侵襲、增殖和EMT[17]。LINC01140、miR140-5p和FGF9形成了一個lncRNA-miRNA-mRNA軸,它調節膀胱癌的表型,通過腫瘤微環境影響巨噬細胞M2極化,進而影響膀胱癌細胞的侵襲性[18]。然而部分文獻報道其他腫瘤中LINC01140的生物學作用有一定的差異,LINC01140在腦膠質瘤中表達增強,通過調節miR199a-3p/ZHX1軸來促進膠質瘤的發展[19]。LINC01140在肺癌組織和細胞系中高表達,LINC01140水平升高與肺癌患者的生存不良有關。LINC01140過表達可保護c-Myc和PD-L1mRNA免受miRNAs的抑制,促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸[20]。結果提示LINC01140在不同腫瘤中可能發揮著不同的調控作用,然而其調控網絡機制仍需進一步的探索及驗證。

眾所周知,細胞周期的異常調節會導致細胞無法控制的增殖,并發生各種癌癥,包括肝膽胰癌。然而,以前從未研究過確切的調控機制。在本項研究中,構建LINC01140-miRNA-mRNA調控網絡及富集分析,LINC01140參與有絲分裂細胞周期調節,下調的LINC01140可能誘導細胞周期的異常調節,在有絲分裂核分裂過程中,當染色質結構發生變化時,有絲分裂基因容易被激活,這為癌細胞的增殖創造了有利條件。當然還需要進一步的研究來驗證這些結論。

綜上所述,本研究發現LINC01140在肝膽胰癌中低表達,可能發揮抑癌作用,低表達具有較差的預后,預示其可能成為肝膽胰癌的預后生物標志物。在肝膽胰癌中LINC01140可能通過LINC01140-miRNA-mRNA來實現對靶基因的調控,為肝膽胰癌患者靶向治療提供新思路。