砂仁對反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護作用*

馬 瓊，閆龍騰，趙 茜，胡冬雄

1 云南中醫藥大學基礎醫學院，云南 昆明 650504；2 云南省高校中醫證候微觀辨證重點實驗室，云南 昆明 650504

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是臨床中常見的胃腸道疾病，其發生原因為胃、十二指腸的內容物反流到食管進而引起食管黏膜損傷［1］。近年來隨著人們飲食結構的改變，特別是高能量食物攝入的增加，本病的發生率逐年升高［2］，已經引起了大量學者的關注。治療本病的藥物在西藥領域以奧美拉唑為代表［3］，中藥在治療本病方面具有較多的優勢，具有用藥靈活、毒副作用小等特點［4］。近年來研究發現，砂仁藥理活性較高，對十二指腸炎、胃潰瘍、淺表性胃炎等腸胃疾病均具有很好的調節作用［5-7］。本研究采用“4.2 mm 幽門夾+胃底2/3 結扎術”法構建了RE 大鼠模型，以觀察砂仁對其是否有調節作用，并從氧化應激和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase2，NOS2）方面研究其作用機制，為臨床治療RE提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性SD 大鼠100 只，體質量160～180 g，購于昆明醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK（滇）2015-0002。飼養條件：大鼠飼養于SPF 級標準實驗動物房：溫度22～27 ℃，濕度40%～60%，光照/黑暗=12 h/12 h，日常自由飲水和進食。動物實驗遵守實驗動物福利倫理審查指南。

1.2 藥品及試劑25%砂仁水提液（昆明植分生物技術有限公司，批號：120985-201406）；奧美拉唑（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20059769，規格：10 mg/粒）；超氧化物歧化酶試劑盒（superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所，批號：S0088）；丙二醛試劑盒（malondialde-hyde，MDA）（南京建成生物工程研究所，批號：MM-21303R1）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）（ELISA）試劑盒［研域（上海）化學試劑有限公司，批號：A013-2-1］；血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）抗體（德國Abcam 公司，批號：40077-57-4）；P 物質（substance P，SP）（批號：S0073）、NOS2 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa 公司，批號：abx053065，AB-2834113）；二抗（北京中杉金橋生物科技公司，批號：A9169-2ML）；PVDF 膜（德國默克生命科學技術有限公司，批號：LM1136）；引物由上海生物生工提供。

1.3 實驗儀器HZK-110 型電子分析天平（賽恩斯儀器設備有限公司）；725 型超低溫冰箱（美國Thermo Forma 公司）；TGL-16.5M 型低溫高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；UV-8000型紫外-可見分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；YT-MB96 型酶標儀（山東云唐智能科技有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白電泳儀（美國伯樂生命醫學產品有限公司）；CFX384Touch 型實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂生命醫學產品有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 100 只SD 大鼠，隨機選取10只作為假手術組，其余90 只構建RE 動物模型，模型構建成功后，排除死亡以及造模不成功的大鼠后，隨機選取50 只，將其分為模型組，奧美拉唑組，砂仁低、中、高劑量組，每組10只。

1.4.2 造模方法 采用鄒文獻［6］“4.2 mm 幽門夾+胃底2/3 結扎術”構建RE 大鼠模型，模型構建時，采用3 mL，1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術臺使其胸腹部充分暴露，并用繃帶將其四肢和牙齒固定，固定后采用寬度為3.0 mm 的雙扁鐵心扎線在纏繞成一個直徑為4.2 mm 的幽門夾，后切開腹部組織，找到幽門和十二指腸交界處，給其套上幽門夾并用血管鉗夾緊，后以3/0 線系住幽門夾閉合端，另一端結扎2/3 胃底。上述完成后給予腹腔注射頭孢拉定和甲硝唑以防止其感染，完成后采用縫合線縫合腹膜和皮膚，再次用酒精消毒后即完成手術，假手術組只開腹不做其他處理，15 min 后逐層縫合腹部傷口。所有大鼠術后禁食不禁水24 h，24 h 后可自由飲食。術后2周，每組各取2只麻醉處死收集食管組織，將其采用組織固定液固定24 h 后取出，行HE 染色觀察病理學，當顯示有明顯組織病理學改變后確認造模成功。

1.4.3 給藥方法 假手術組和模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，奧美拉唑組給予奧美拉唑2 mL/（kg·d）灌胃，砂仁低、中、高劑量組分別給予砂仁水提取液5、10、20 mL/（kg·d）灌胃。治療時間為4周。

1.5 標本采集治療4 周后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，剖開大鼠腹腔，將食道取出，平均分為3 個部分，其中一部分置入組織固定液中保存用于HE 染色，另一部分取出后直接放入超低溫冰箱備用于相關蛋白和生化指標的檢測，最后一部分浸入RNA保護液中用于相應mRNA的檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 HE 染色組織病理學觀察 從組織固定液中取出食道組織，由武漢塞維爾生物按照常規操作完成制作，采用熒光倒置顯微鏡采集大鼠食管組織病理圖片。根據《反流性食管炎診斷及治療指南（2003 年）》的ER 基本病理改變，觀察食管鱗狀上皮增生，黏膜增厚，黏膜固有層乳頭向表面凸起情況，以及上皮層內黏膜炎細胞浸潤情況。

1.6.2 MDA、SOD 及NO 含量檢測 從超低溫冰箱中取出食道組織，稱取50 mg，加入0.5 mL 預先冷卻過的生理鹽水充分碾磨使其勻漿，完成后將其進行離心（離心半徑：10 cm，2500 r/min，4 ℃）15 min。完成后提取上清，根據試劑盒提供的說明書檢測MDA、SOD以及NO含量即可。

1.6.3 VIP、SP和NOS2蛋白表達檢測 稱取100 mg食道組織，采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白后，BCA法對其進行定量并調平，再每組各取50 ug行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳，電泳完成后將其用半干轉移法轉移到PVDF 膜，完成后采用牛血清蛋白封閉2 h，后加入一抗過夜，次日加入二抗1 h，PBS 洗滌后暗室曝光洗片即完成，結果比較采用Image J計算各條帶的灰度值即可。

1.6.4 VIP、SP和NOS2 mRNA的檢測 稱取20 mg食道組織，提取總RNA后將其逆轉錄為cDNA，完成后每組各取2 μg 行PCR 擴增反應，擴增條件為95 ℃ 2 min、94 ℃10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s，循環次數34 次。分析比較結果采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統計學方法統計分析采用SPSS 23.0 統計學軟件，計量資料采用±s表示，兩組間比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析，多組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學變化大鼠食管組織HE 染色可見，假手術組食管黏膜較為光滑、結構清晰完整，細胞排列整齊，沒有炎癥現象，而模型組則出現明顯的黏膜增厚，同時角質化增厚，局部黏膜有乳頭樣凸起，各治療組相較于模型組病理學變化有明顯改善，且隨著劑量的升高，食管病理改善效果越明顯；與奧美拉唑組相比，砂仁低、中劑量組改善食管病理學情況沒有奧美拉唑組顯著，而高劑量組與奧美拉唑組療效相似。見圖1。

2.2 大鼠食管組織氧化和抗氧化指標與假手術組相比，模型組大鼠食管黏膜組織中SOD明顯降低（P＞0.05），而NDA和NO則明顯升高（P＞0.05）；與模型組相比，各治療組SOD 明顯升高，而MDA 和NO明顯降低（P＞0.05）。隨著砂仁劑量的升高，SOD明顯升高、MDA 和NO 降低的效果越來越好。與低劑量相比，砂仁高劑量組SOD 明顯升高、MDA 和NO顯著降低（P＞0.05），而與砂仁中劑量相比差異沒有統計學意義（P＞0.05）。通過與奧美拉唑組相比，砂仁低、中劑量組SOD水平降低、MDA和NO水平升高（P＞0.05）；而SOD、MDA 和NO水平高劑量組與奧美拉唑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠食管組織中氧化和抗氧化指標比較（±s）

表2 各組大鼠食管組織中氧化和抗氧化指標比較（±s）

注：與假手術組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與低劑量組相比，**表示P＞0.05；與中劑量組相比，***表示P＞0.05

SOD（U/gprot）162.68±16.72 89.67±32.27*136.76±16.58#105.18±17.25#^124.62±16.21#^**134.57±15.36#**組別假手術組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10 MDA（nmol/mgprot）4.68±1.08 10.35±2.14*6.53±1.06#8.04±1.45#^7.56±1.21#^6.68±1.04#**NO（μmol/gprot）2.01±0.52 4.58±0.65*3.06±0.41#4.20±0.43#^3.76±0.51#^3.15±0.48#**

2.3 VlP、SP和NOS2蛋白表達與假手術組相比，模型組大鼠VIP 蛋白表達明顯降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表達明顯升高（P＞0.05），而各治療組相較于模型組，VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05），且隨著砂仁劑量的升高，VIP 升高、SP 和NOS2 降低水平越明顯。與低劑量相比，砂仁中、高劑量組VIP 明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05），而高劑量與中劑量相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。與奧美拉唑組相比，砂仁低、劑量組VIP 蛋白表達降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表達升高（P＞0.05）；砂仁中、高劑量組改善SP 和VIP 蛋白表達情況優于奧美拉唑組（P＞0.05），而改善NOS2蛋白表達水平，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2，表3。

圖2 各組大鼠食管組織VIP、SP和NOS2蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2蛋白相對表達量比較（±s）

注：與假手術組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與砂仁低劑量組相比，**表示P＞0.05；與砂仁中劑量組相比，***表示P＞0.05

VIP 0.82±0.06 0.48±0.12*0.56±0.09#0.53±0.12#0.68±0.07#^**0.79±0.07#^**組別假手術組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10 NOS2 0.65±0.12 1.15±0.14*0.68±0.08#0.87±0.12#^0.76±0.11#**0.73±0.14#**SP 0.27±0.08 0.98±0.15*0.46±0.10#0.57±0.16#^0.44±0.13#^**0.35±0.11#^**

2.4 VlP、SP及NOS2 mRNA表達與假手術組相比，模型組大鼠VIP 蛋白表達明顯降低（P＞0.05），SP和NOS2 蛋白表達明顯升高（P＞0.05），而各治療組相較于模型組，VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP和NOS2 明顯降低（P＞0.05），且隨著劑量的升高，改善效果越顯著。與砂仁低劑量相比，砂仁中、高劑量組VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05）；砂仁中、高劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。與奧美拉唑組相比，各治療組VIP 升高，SP 和NOS2 降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。砂仁高劑量組表現出最優劑量。見表4。

表4 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2 mRNA表達量（±s）

表4 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2 mRNA表達量（±s）

注：與假手術組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與砂仁低劑量組相比，**表示P＞0.05；與砂仁中劑量組相比，***表示P＞0.05

VIP 1.02±0.01 0.57±0.09*0.80±0.07#0.74±0.06#0.79±0.06#0.84±0.05#**組別假手術組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10 NOS2 1.02±0.00 1.79±0.16*1.28±0.12#1.36±0.10#1.27±0.08#**1.23±0.09#**SP 1.01±0.01 1.96±0.23*1.47±0.10#1.56±0.11#1.54±0.10#**1.45±0.12#**

3 討論

近年來RE 受到了眾多學者的關注，目前西醫治療本病的藥物有抑酸藥（奧美拉唑、蘭索拉唑等）、促進胃腸動力藥（潘利酮等）和胃黏膜保護劑（鉍劑、前列腺素及其衍生物等）等［8］，上述藥物在使用后見效快，但是不良反應相對較多，且具有較高的復發率。RE 在中醫學中屬于“反胃”“嘈雜”“吞酸”“嘔吐”“梅核氣”等范疇，中醫常以辛開苦降、滋胃降逆法為主治療。中醫藥可明顯改善本病癥狀，同時減輕患者炎癥損傷，促進食管修復［9］。

砂仁屬于藥食同源類藥物，其味辛、性溫，歸脾和胃經，主要功效為化濕行氣、寬中止嘔、暖脾止瀉、安胎、祛痰等［10］。研究發現，砂仁具有較高的藥理活性，特別是在改善胃腸運動、保護胃黏膜、排除消化管積氣和消炎止痛等方面具有明顯的優勢。曹羽等［11］發現，砂仁能夠加速患者胃部手術后的胃腸功能恢復，在臨床水平上驗證了砂仁能夠促進胃腸運動的機制，這可能與其促進體內胃動素（motilin，MLT）、P 物質（substance P，SP）的分泌釋放有關。ZHANG 等［12］研究發現，砂仁揮發油可增加5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）誘導大鼠的體質量，減輕其腹瀉癥狀，砂仁揮發油能通過抑制細胞凋亡、減輕腸胃炎和增強腸黏膜屏障等作用逆轉腸道和炎癥的組織病理學變化，并減少病原細菌的數量，增加益生菌的含量，有效阻止化療后腸黏膜炎的發生和發展。雖然砂仁已經廣泛運用于胃腸道黏膜損傷疾病的治療中并且取得較為滿意的成效，但是砂仁在RE 中的應用鮮有報道。本次研究結果表明，在給予RE 大鼠砂仁水提液低、中、高劑量及陽性藥物后，食管的病理損傷減輕，且砂仁水提液的高劑量可與陽性藥物組效果媲美。表明砂仁水提液可保護RE 大鼠食管黏膜。

關于RE 的發生機制，目前認為，其是因各種生理因素造成的上消化道動力障礙導致酸性反流性的炎癥疾病［13］。上消化道動力障礙可引起下食管括約肌松弛，延遲胃排空時間，引起胃內容物反流進入食道，食管黏膜防御能力減弱，最終引發食管發生病變［14］。在上述過程中，食管下括約肌（low esophageal sphincter，LES）占有關鍵地位［15］，LES 功能狀態可受到多種激素或神經功能的調節［16］，其中對神經功能的調節主要是指其功能狀態受到胃腸激素和胃腸神經的雙重調節。研究發現，調節胃腸神經的兩個關鍵蛋白為血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）和SP，其中SP可引起LES收縮，而VIP的作用正好相反，主要作用為抑制神經遞質傳遞，減弱LES 的收縮能力［17-18］。除上述VIP 和SP 外，NO 也是調節收縮功能的重要因子［19-20］，NO主要受旁分泌調控，主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，NOS 又分為3 個亞型，而與RE相關性較大的主要為NOS2。NOS2 在正常狀態下表達并不明顯，其在經過細胞因子刺激后可過量表達，進而釋放大量的NO，最終使得LES發生松弛，給機體帶來損失。

本研究結果顯示，經砂仁水提液及陽性藥物治療后，RE 大鼠SOD 含量明顯升高，血清MDA、NO明顯降低，表明砂仁水提液可通過調節NO、SOD 及MDA 的分泌進而提高大鼠食管的抗氧化能力，為食管黏膜組織的修復提供有利條件。與假手術組相比，模型組大鼠VIP蛋白及mRNA表達明顯降低，SP 和NOS2 蛋白及mRNA 表達明顯升高，而采用砂仁水提液治療后，VIP明顯升高，SP和NOS2明顯降低，這提示砂仁可以明顯改善上述3 個蛋白的表達，進而抑制食管括約肌松弛，調節胃腸運動，最終保護食管。

基于上述討論提示，砂仁對RE 具有較好的療效，其可以明顯地改善食管黏膜，提高抗氧化能力，分析其作用機制，可能與砂仁可改善VIP、SP和NOS2 蛋白和mRNA 表達，進而提高胃排空、保護食管黏膜有關。