基于網絡藥理學和分子對接技術研究甘草附子湯治療類風濕性關節炎的作用機制*

藍紹航，龐宇舟，區佩琪，韋露秋，羅筱凡，呂 挺

1 廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧 530022； 2 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜的炎性反應和異常增生為病理表現，影響關節和關節外結構的慢性、全身性、自身免疫性疾病［1］，臨床以多關節炎、關節腫痛、軟骨和骨破壞，甚至關節畸形和功能喪失為主要表現特征。我國RA 的患病率約為0.42%，并呈現逐年上升的趨勢［2］。RA 至今病因未明，西醫認為主要與遺傳、感染、內分泌失調和藥物誘導等因素有關，多選用非甾體類抗炎藥、激素、抗風濕藥、生物藥劑及小分子植入藥等治療，但這些藥物存在劑量大、給藥頻繁、毒副作用嚴重等缺點［3］。

RA 屬于中醫“痹證”范疇。《素問·痹論篇》曰：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹也。”［4］《黃帝內經》首提“痹”之病名，明確提出痹證是風、寒、濕三氣雜至，故多以祛風、散寒、除濕為基本治法。甘草附子湯源自張仲景《傷寒雜病論》：“風濕相摶，骨節疼煩，掣痛不得屈伸，近之則痛劇，汗出短氣，小便不利，惡風不欲去衣，或身微腫者，甘草附子湯主之。”［5］方中桂枝溫通陽氣，祛風和營；白術苦溫，健脾燥濕；附子辛熱扶陽溫經，長于祛寒。附、桂、術三藥相伍，既除風、寒、濕，又溫表陽而固衛氣，故被譽為治風濕之圣藥［6］。又痹證急而劇，甘草既調和諸藥，又緩急止痛。全方合用，可有效抓住RA 病源，切中病機，扼其病勢，提高療效。近年來運用甘草附子湯治療RA 也取得一定的研究進展，廖常志運用甘草附子湯治療RA 患者23 例，總有效率達100%［7］。王穎等［8］通過數據挖掘對治療RA 常見藥物頻次總結后發現，桂枝和甘草分別排在出現頻次最高的第2 位和第4 位。研究發現，甘草附子湯能抑制T 淋巴細胞的增殖與分化，減少炎性細胞向滑膜組織的浸潤，下調血清相關細胞因子白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）的表達水平，進而起到抗炎和消除關節腫脹的作用［9］。此外，蔡悅等［10］研究發現，甘草附子湯可通過減少TNF-α、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性細胞因子的產生，降低滑膜組織中基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinases-1）、MMP-3蛋白表達，從而抑制RA小鼠關節炎癥和骨侵蝕的發生。

目前對于甘草附子湯治療RA 的研究較多，但尚未對其作用機制進行系統闡釋。網絡藥理學是基于系統生物學、藥理學、藥物化學和生物化學的一門綜合性的新興學科，為中藥發展提供新的研究思想，是藥物研究的新模式［11］，為明確藥物作用機制、新藥研發、復方用藥等提供理論依據和技術支撐［12］。同時，分子對接（molecular docking）也可揭示藥物治療疾病的分子機制，將藥理作用上升到分子水平上，為研究藥物機制奠定物質基礎［13］。因此，本研究基于網絡藥理學結合分子對接技術，利用甘草附子湯中的化合物和受體分子虛擬結合，發現其作用靶點和結合位點，闡述甘草附子湯多成分、多靶點、多通路的協同作用機制，彌補片面的、不系統的研究，為后續深入研究提供相應的理論基礎和科學依據。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點預測在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，and analysis platform，TCMSP）數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選甘草附子湯（甘草、附子、桂枝、白術）的全部化學成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性指數（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選標準，確定藥物的活性成分。然后在Related Targets一欄中找出其所對應的作用靶點，將所有藥物靶點進行合并整理，剔除重復的藥物靶點，在Uniport數據庫（https：//www.uniprot.org/）中輸入靶點名稱并限定物種為homo sapiens（human），對靶點進行蛋白名稱標準化，獲得靶點對應的標準基因名。

1.2 RA疾病靶點獲取以“rheumatoid arthritis”為檢索詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Pharm-Gkb（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）等數據庫獲取RA 相關靶點基因。對收集的所有RA 靶點進行處理，刪除重復靶點，即為所需的RA 總靶點。再利用R 語言繪制RA 靶點基因交集Venny圖。

1.3 甘草附子湯與RA 交集靶點篩選將上述獲得的藥物靶點與疾病靶點基因通過R 語言繪制Venny 圖，對甘草附子湯活性成分靶點與RA 相關靶點基因進行映射，得到藥物與疾病交集靶點。

1.4 構建活性成分-核心靶點網絡將以上所得的甘草附子湯所有藥物的活性成分交集和RA 靶點基因交集數據導入Cytoscape 3.7.2 軟件，并對其參數進行設置，得到活性成分-核心靶點相互作用網絡圖。

1.5 構建蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPl）網絡及核心基因預測將篩選得到的“Drug-Disease”中的靶點蛋白導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/），限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設置為“0.900”，同時設置隱藏游離點，其余參數保持默認，進行蛋白質互作分析，得到PPI 網絡圖。將獲得數據導入Cytoscape 3.7.2 軟件，使用Network Analyzer插件對PPI網絡進行拓撲分析篩選關鍵基因。

1.6 GO 功能富集分析與KEGG 通路分析將“1.3”項下篩選得到的藥物疾病靶點交集通過導入R 語言軟件中進行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。兩者皆以P＜0.01為篩選標準。

1.7 分子對接為驗證篩選出的甘草附子湯治療RA 可能關鍵靶點的準確性，將“1.1”項和“1.5”項中整理出的排名靠前的活性成分與藥物靶點進行 分 子 對 接。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載活性成分的小分子配體2D 結構，將2D 文件導入ChemBio3D Ultra 14.0軟件生成3D結構，使用優化模塊進行分子結構優化，獲取最穩定的分子構象。從PDB（https：//www.rcsb.org/）數據庫下載靶點蛋白受體三維結構，并將其導入PyMOLWin 軟件，輸入命令刪除靶蛋白的水分子和小分子配體，完成蛋白受體準備。將蛋白受體文件導入AutoDock-Tools-1.5.6 軟件中，對蛋白分子加氫等處理，保存文件為pdbqt 格式，再將小分子配體文件導入AutoDockTools-1.5.6 軟件中，把文件轉換為pdbqt 格式。以靶點的原型配體所在位置的中心定義為活性對接口袋位點，口袋大小設為1.0 nm，其他參數根據需要適當調整，確定活性口袋，使用Autodock vina軟件進行對接。

2 結果

2.1 甘草附子湯有效活性成分篩選及靶點預測經TCMSP 數據庫搜索，搜索關鍵詞為“甘草、桂枝、白術、附子”，以OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，檢索到甘草附子湯4 味藥材的有效活性成分共有127 個，其中甘草92 個、桂枝7 個、白術7 個、附子21 個。整理后預測靶點為1895 個，經Uniprot 數據庫標準化注釋并刪除重復靶點后得到133個作用靶點。見表1。

表1 “中藥-活性成分-疾病靶點”信息 個

2.2 藥物靶點與疾病靶點交集經分析得到藥物潛在活性成分靶點133個，RA疾病基因3750個，見圖1；二者得出的交集靶點基因為133個，見圖2。

圖1 疾病基因合并Venny圖

圖2 藥物靶點和疾病靶點Venny圖

2.3 活性成分-核心靶點相互作用網絡將“2.2”得到的133 個交集靶點運用Perl 相關腳本進行文件處理，所得數據導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化網絡構建，得到活性成分-核心靶點相互作用網絡圖，見圖3。圖3中圓形節點代表藥物的有效成分，綠、紅、橙、藍色分別代表甘草、白術、桂枝、附子的有效成分，多個顏色代表多個藥物共同的有效成分，灰色線條代表邊，黃色三角形節點代表中藥和疾病的交集靶點。圖中共有246個節點，其中來源于化合物的有99個，來源于基因的有147 個；經統計degree 較高的有效成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、芒柄花素（formononetin）等。見表2。

圖3 活性成分-核心靶點相互作用網絡圖

表2 度值大于20的前4位化學成分

2.4 PPl 網絡及核心基因預測將“2.2”項得到的133 個交集靶點導入STRING 數據庫，設定物種為“Homo sapiens”，得出string_interactions文件，并以tsv 格式保存。網絡圖共有132 個節點、435條邊，平均每個節點的度值為6.59，平均局部聚類系數為0.489，PPI enrichment p-value值為＜1.0e-16，鄰接節點數目越多，說明這些蛋白在網絡中的作用越顯著。見圖4。將tsv 格式文件數據導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，使用Network Analyzer 插件對PPI 網絡進行拓撲分析篩選關鍵基因，處于核心位置的靶點有JAK2、JUN、IL-10、TNF、CSF2、CCL2、JAK3、IL-1B、JAK1、MAPK14、IL-2、IL-6等，提示這些基因在PPI中發揮了關鍵作用。見圖5。

圖4 交集基因PPI網絡圖

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析經GO富集分析共得到1912 條富集結果，其中生物過程（biological process，BP）1792 個，主要涉及對細胞因子產生的正調控、對細胞黏附調節、對炎癥反應的調節、對細菌源分子的反應、對脂多糖的反應等生物過程的調節；細胞組分（cellular component，CC）28 個，主要涉及質膜外側、膜筏、膜微區、膜區等細胞組分；分子功能（molecular function，MF）89個，主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性等。提示甘草附子湯在治療RA 過程中通過參與調控多種生物學過程而發揮作用。見圖6。

圖6 交集基因GO條形圖

經KEGG 通路富集分析共得到131條通路富集結果，主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、恰加斯病、類風濕性關節炎、新型冠狀病毒肺炎、肺結核、人巨細胞病毒感染、TNF信號通路）、破骨細胞分化、人T細胞白血病病毒1感染等。提示甘草附子湯可能通過以上通路發揮對RA的治療作用。見圖7。

圖7 交集基因KEGG條形圖

2.6 潛在活性成分-核心靶點分子對接分析根據甘草附子湯“活性成分-核心靶點”網絡中靶點與成分連接的度值，選取活性化合物中degree＞20 的槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素4 個主要有效成分，分別與經拓撲分析篩選后的關鍵核心靶點IL-6、JUN、MAPK14 進行分子對接。分子之間結合能量較低的構象則較為穩定，篩選對接結果中結合能量低的分子構象即為最優對接結果，結果表明槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素與IL-6、JUN、MAPK14 的結合能均≤-6.0 kcal/mol，展現出良好的結合力。見圖8，表3。

圖8 潛在活性成分-核心靶點分子對接分析

表3 槲皮素、山柰酚、柚皮素和芒柄花素與RA潛在靶點結合能量 kcal/mol

3 討論

甘草附子湯臨床應用廣泛，為深入研究其治療RA 的作用機制，本研究采用網絡藥理學的方法，共篩選出127 個活性成分及133 個靶點，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素等活性成分對應靶點較多，是甘草附子湯治療RA 的主要成分。槲皮素具有抗炎、抗氧化、調節免疫等作用［14-15］，可促進RA成纖維樣滑膜細胞的凋亡［16］，降低IL-1β誘導的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）產物量與MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量表達，抑制NF-κB激活，減弱炎癥環境下軟骨細胞內MMP-13 的產生、基質降解和細胞凋亡，從而起到保護軟骨的作用［17-18］。山柰酚具有顯著的抗炎作用，可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等信號通路的表達，調控炎癥反應過程，減少炎癥因子產生，從而有效抑制炎癥的發生發展［19］。柚皮素、芒柄花素等活性成分也有抗炎、抗氧化、調節免疫等作用［14-15］，但關于其治療RA 的作用目前鮮見報道，這可作為將來研究中藥活性成分治療RA 的新方向。上述成分在經過分子對接后進一步驗證其可信度，為下一步臨床研究治療RA提供了新依據。

通過PPI 網絡拓撲分析后篩選到JAK2、JUN、IL-10、TNF、CSF2、CCL2、JAK3、IL1B、JAK1、MAPK14、IL-2、IL-6 等12 個核心靶點，其中以IL-6 最為關鍵。IL-6 是活動期RA 患者血清及關節液中含量最高的細胞因子之一，其功能涉及多種與炎癥相關的疾病狀態，包括對糖尿病和全身性RA 的可疑性［20-21］。同時，破骨細胞活性與關節破壞程度密切相關，IL-6 作為一種炎性因子，可引起人體內破骨細胞與成骨細胞之間的平衡失調，是造成RA發生發展的主因之一［22］。高濃度的IL-6 可刺激骨吸收的調節作用，進一步刺激破骨細胞的前體細胞，激發破骨細胞活性，導致骨質破壞，通過多通路、多靶點參與RA 的炎癥反應過程［23-24］。抑制IL-6的表達已成為治療RA的新方法［25］，托珠單抗（tocilizum）是目前廣泛應用于臨床治療RA 的強效藥，可通過結合IL-6 跨膜及溶解性受體來抑制IL-6 介導的信號轉導，從而有效地緩解癥狀，預防關節破壞［26-27］。絲裂原活化蛋白激酶（MAKP）可參與細胞分化、增殖、生長、免疫調控等多種活動［28］，有研究發現，microRNA-137 通過MAPK 信號通路和IL-6/COX-II 活化在PMS 誘導的RA 急性加重中起重要作用［29］。轉錄因子AP-1（JUN）由多種蛋白復合物組成，廣泛參與調節細胞生命，如細胞分化、增殖、凋亡等過程，與外界環境壓力、細菌及病毒感染、多種疾病和病理損傷的發生發展密切相關，如神經退行性疾病、RA、腫瘤等［30-31］。TNF靶點也非常重要，TNF 參與機體的免疫調節和炎癥反應［32］，而TNF-α 在維護骨、軟骨組織的完整性及促進損傷修復方面發揮重要作用［33］。相關研究表明，其余靶點基因也與RA 密切相關，在此不再贅述。由此推測，甘草附子湯中的中藥有效成分可能是通過上述靶點發揮治療RA的作用。

GO 富集分析主要涉及對細胞因子產生的正調控、對細胞黏附調節、對炎癥反應的調節、對細菌源分子的反應、對脂多糖的反應等生物過程的調節。其中，細胞因子是RA 炎癥及關節損傷的重要介質，是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長及損傷組織修復等多種功能，細胞因子網絡的不平衡可能誘導和維持炎癥及相應的組織損傷，在RA 發病機制中有重要作用，與RA 最密切相關的細胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-2 等［34-36］。脂多糖可刺激內皮細胞誘導轉錄因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活性升高，并上調其他炎癥因子（如TNF-α、IL-1β）的表達，導致炎癥的持續發生以及骨質的持續破壞并與其發生協同作用，產生炎癥性疾病［37］。由此可知，在RA 的病理過程中，炎癥反應是重要環節，如何使用中藥緩解RA的炎癥反應是治療的重要內容。

KEGG 通路富集分析結果顯示，甘草附子湯作用RA 的靶點主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、恰加斯病、類風濕性關節炎、新型冠狀病毒肺炎、肺結核、人巨細胞病毒感染、TNF 信號通路、破骨細胞分化通路、人T 細胞白血病病毒1 感染等。以上通路大多數涉及炎癥反應和骨破壞，而炎癥反應和骨破壞是RA 的主要臨床表現，骨平衡被破壞是導致骨侵蝕的主因，炎癥反應直接或間接誘導破骨細胞分化，并使其功能減少，導致RA骨破壞［38］。TNF信號通路是炎癥反應的重要通路，可以激活MAPK/NF-κβ等加劇炎癥反應［39］。良好的TNF 抑制劑臨床療效也驗證了該因子及其通路在RA 中的重要地位［40］。除上述信號通路外，尚有多條信號通路參與甘草附子湯治療RA 的過程，這些信號通路為我們進一步研究甘草附子湯與RA 的關系提供一定依據和思路。由此預測，甘草附子湯主要是通過調節上述通路下調炎性因子表達，調節骨代謝，干預骨破壞，調節免疫功能等發揮治療RA的作用，從而改善患者的生活質量。

為驗證網絡預測的準確性，利用分子對接技術，選取甘草附子湯中4 個核心活性成分（槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素）與關鍵靶點IL-6、JUN、MAPK14 結合，結果提示結合能量均≤-6.0 kcal/mol，匹配能量較低，說明小分子與大分子結合的構象穩定，結合性好，展現出良好的親和力，也驗證了本研究成果。

綜上所述，RA 是一種病理機制非常復雜的疾病，甘草附子湯治療RA 的作用機制是一個多基因、多生物過程及多信號通路共同參與過程，符合中藥治療疾病多成分、多靶點的特征。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，初步預測甘草附子湯對RA 的主要有效成分、作用靶點、相關通路及協同作用的分子機制，為后續進一步開展機制研究、藥物開發及臨床試驗等奠定基礎，也提供了理論依據、線索與思路。