基于網絡藥理學和分子對接探究“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機制*

王璐瑤，張培彤，羅 鉞，黃 蓉，林月潔，王 菁，李 蒙

1 北京中醫藥大學，北京 100029； 2 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053；3 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700

肺癌是最常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率均居首位［1］。治療肺癌的手段除了手術、化學治療、放射治療、靶向治療及免疫治療外，中醫藥在預防腫瘤發生、減毒增效、減少腫瘤復發和轉移等方面也具有獨特優勢［2］。目前主流觀點認為腫瘤患者普遍存在血瘀證，活血化瘀法可抑制腫瘤生長、改善血液高凝狀態、抑制侵襲和轉移、延長患者生存時間并提高生活質量［3］。川芎和丹參均屬于臨床上常用的活血藥，作為丹參川芎嗪注射液、丹芎通脈顆粒等活血化瘀藥的重要組成，川芎偏于活血行氣，丹參長于養血活血，兩者相須為用共奏活血化瘀之功。目前研究已證明川芎和丹參兩味中藥均具有抗腫瘤作用［4-6］，但中藥成分復雜，兩藥配伍存在協同或拮抗作用，現代研究缺乏對“川芎-丹參”藥對的作用機制及藥理研究。網絡藥理學通過“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡系統分析藥物與疾病的關系［7］。本研究旨在通過網絡藥理學方法對“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機制進行探討，為臨床應用活血化瘀藥物治療肺癌提供理論基礎，為后續研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “川芎-丹參”藥對活性成分篩選及作用靶點通過TCMSP 數據庫［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索川芎、丹參的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分較高的化合物，檢索文獻進行補充，獲得蛋白作用靶點，利用Uniprot 數據庫［9］（https：//www.uniprot.org/）對藥物靶點進行標準化命名。

1.2 肺癌疾病靶點獲取通過GeenCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）檢 索“Lung Cancer”，獲取肺癌疾病靶點。

1.3 藥物活性成分-共同靶點-疾病網絡構建利用BioVenn 在線軟件［10］將“川芎-丹參”藥對藥物靶點與肺癌疾病靶點取交集得到共同靶點，以Venn 圖的形式展現，將共同靶點與藥物活性成分進行匹配，使用Cytoscape 軟件構建藥物活性成分-共同靶點-疾病網絡，篩選出藥物活性成分中與疾病靶點相關的主要成分作為“川芎-丹參”藥對治療肺癌的主要活性成分。

1.4 關鍵靶點篩選及網絡構建將共同靶點上傳 至STRING 在 線 平 臺 數 據 庫［11］（https：//string-db.org/cgi/input.pl）構建蛋白相互作用網絡。將蛋白互作網絡數據導入Cytoscape 軟件，使用CytoHubba 模塊分析獲取網絡中degreee值排名前10 位的靶點作為“川芎-丹參”治療肺癌的關鍵靶點，生成關鍵靶點蛋白相互作用網絡。

1.5 功能富集分析與信號通路分析將關鍵靶點 上 傳 至 Metascape 數 據 庫［12］（https：//metascape.org/），以人類為研究對象，進行基因本體論功能分析（gene ontology，GO）以獲得關鍵靶點的作用過程京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析以了解關鍵靶點在通路中的分布情況，利用微生信在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對分析結果進行可視化。

1.6 分子對接通過PDB 數據庫［13］（http：//www.rcsb.org/）查找關鍵靶點中degree 值排名前5的靶點對應的蛋白質3D結構，以此為受體；主要活性成分及臨床報道有效藥物作為配體，利用CB-Dock 網 站［14］（http：//cao.labshare.cn/cbdock/）進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 “川芎-丹參”藥對活性成分及作用靶點利用TCMSP 數據庫分別檢索川芎、丹參，共獲得391個化學成分，其中川芎189 個、丹參202 個，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，再結合文獻研究補充川芎嗪、川芎內酯、阿魏酸以及齊墩果酸、丹參素、丹參酮I、原兒茶醛，最終篩選出川芎有效成分10個，丹參有效成分69 個。分別獲取有效成分對應的靶點，利用Uniprot 數據庫進行標準化命名，篩選得到149個預測靶點。見表1。

表1 “川芎-丹參”藥對活性成分

2.2 肺癌疾病靶點獲取通過GeenCards 數據庫獲得肺癌疾病靶點23107 個，通過篩選設置relevance score≥25.18，最終獲得725個相關靶點。

2.3 藥物活性成分-交集靶點-疾病網絡構建利用BioVenn 在線軟件將“川芎-丹參”藥對活性成分對應的149 個潛在靶點與肺癌對應的725 個疾病靶點取交集，以Venn 圖的形式得到74個共同靶點，見圖1。將74 個共同靶點與藥物活性成分相匹配，得到“川芎-丹參”藥對發揮抗肺癌作用的藥物活性成分，導入Cytoscape 軟件，得到藥物活性成分-共同靶點-疾病關系網絡，見圖2，計算degree 值，篩選出排在前五名的成分作為主要活性成分，依次是木犀草素、丹參酮ⅡA、楊梅酮、二氫丹參內酯和丹參新醌丁。

圖1 “川芎-丹參”藥對活性成分靶點與肺癌疾病靶點Venn圖

圖2 “藥物活性成分-共同靶點-疾病”網絡

2.4 關鍵靶點篩選及網絡構建將74 個共同靶點上傳至STRING 在線數據庫平臺，以TSV 格式保存蛋白質相互關系，將其導入Cytoscape 軟件，利用CytoHubba 模塊進行網絡分析，篩選出Degree值排名前10 位的基因靶點，依次是TP53、AKT1、MAPK1、VEGFA、EGFR、MYC、JUN、CASP3、STAT3、ESR1，以此作為“川芎-丹參”藥對治療肺癌的關鍵靶點，構建關鍵靶點蛋白相互作用網絡，見圖3，網絡節點的顏色按Degree值從高到低，由紅色向黃色漸變。

圖3 關鍵靶點蛋白互作網絡

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析通過Metascape 數據庫對10 個關鍵靶點進行富集分析，以P＜0.01為篩選標準，獲得GO生物過程條目385 條，GO 細 胞 組 分11 個，GO 分 子 功 能17 個，KEGG相關信號通路139條。分別篩選3種GO功能分析結果中排名前10 的條目，進行可視化，見圖4。KEGG通路富集去除廣泛通路后取前20條信號通路進行可視化，見圖5，主要涉及到MAPK信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Thyroid hormone 信號通路等。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接CB-Dock 網站可預測給定蛋白質的結合位點，使用基于曲率的新型腔檢測方法計算中心和大小，執行AutoDock Vina 分子對接［15］。Vina 得分值越低代表受體和配體親和力越高，空腔尺寸接近或大于配體表明對接準確性更高。吉非替尼作為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，改善EGFR 突變陽性肺癌患者的無進展生存期優于一線和二線化療藥物［16］，故將吉非替尼與“川芎-丹參”藥對主要活性成分進行比較。對接結果提示，親和力最高的前5 位分別是吉非替尼和雌激素受體1、吉非替尼和絲裂原活化蛋白激酶1、丹參酮ⅡA 和骨髓細胞增多癥病毒癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白、丹參新醌丁和MYC蛋白以及楊梅酮和雌激素受體1。見表2、圖6。

圖6 Vina得分最低的前5種對接模式

表2 主要活性成分-關鍵靶點分子對接結果

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法初步篩選出“川芎-丹參”藥對與肺癌相關的主要活性成分是木犀草素、丹參酮IIA、楊梅酮、二氫丹參內酯和丹參新醌丁。研究證明，木犀草素通過上調Caspase-3的表達同時抑制磷酸化蛋白激酶（Phospho-Akt，p-Akt）、基質金屬蛋白酶2 的表達，抑制Src/FAK 及其下游Rac1、Cdc42 和RhoA 信號傳導途徑來抑制肺癌細胞增殖、侵襲及遷移［17-18］。丹參酮ⅡA通過上調P27的表達，誘導非小細胞肺癌細胞周期S期發生阻滯，聯合順鉑則通過下調PI3K/Akt 信號通路在體內外協同抑制非小細胞肺癌，誘導細胞凋亡，發揮抗肺癌作用［19-20］。楊梅酮亦具有促進細胞凋亡的能力，能顯著增加肺腺癌細胞早期凋亡率，使細胞周期阻滯在G0/G1期［21-22］。但目前對二氫丹參內酯和丹參新醌丁的抗肺癌作用研究報道相對較少，值得進一步探究。根據藥物主要活性成分，楊梅酮來源于川芎，其余均來源于丹參，初步推斷藥對中丹參發揮的抗肺癌作用更大，而兩藥相須為用能增加其抗肺癌作用。

根據關鍵靶點蛋白互作網絡可知，“川芎-丹參”藥對主要是作用于TP53 基因（tumor protein P53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等關鍵靶點，從而發揮抗肺癌作用。通過分子對接驗證了關鍵靶點與主要活性成分均有較好的對接活性，表明“川芎-丹參”藥對主要活性成分能對關鍵靶點發揮調控作用。抑癌基因TP53 是人類腫瘤中最常見的突變基因，其功能的喪失可加速肺癌中驅動癌基因的轉化潛能，并阻礙腫瘤對細胞毒性化學療法、放療及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑的反應［23-25］。AKT1 在包括肺癌在內的許多癌癥中變得高度活化，在調節異常細胞增殖、抑制程序性細胞死亡、端粒酶活化及促進血管生成和腫瘤細胞侵襲等方面發揮重要作用［26-27］。在肺癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中均可檢測出MAPK1 的活化或高表達，研究證明miR-105-5p 通過下調MAPK1 抑制肺癌細胞［28］。

通過KEGG 通路富集分析，發現“川芎-丹參”藥對與肺癌相關度排名前三名的信號通路分別是MAPK、PI3K-Akt 和Thyroid hormone。經 典 的MAPK 通路是由ERK1/2 信號傳導蛋白介導的，ERK被激活將通過轉位進入細胞核，激活轉錄因子和激酶等，參與調控細胞周期、增殖、分化、凋亡等多種生理過程［29］。研究證明，川芎嗪能下調MAPK 通路中ERK 的表達并升高JNK 和P-38 的表達，促進肺癌順鉑耐藥細胞株凋亡［30］。PI3K-Akt 通路與腫瘤細胞治療抗拒、增殖凋亡、周期調控、侵襲轉移及血管形成等過程密切相關，Akt 是PI3K 下游關鍵蛋白，Akt 被激活可使下游靶點mTOR 發生磷酸化，被活化的mTOR 可調控其上游癌基因及抑癌基因的表達水平，干預腫瘤生長［31-32］。甲狀腺激素通過與αvβ3 整聯蛋白上的TR 相互作用來調節腫瘤增殖，刺激MAPK/ERK1/2 信號的激活，加速肺癌轉移和進展［33］。

本研究主要運用網絡藥理學方法，對“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機制進行探究，證明“川芎-丹參”藥對通過木犀草素、丹參酮IIA、楊梅酮等多種活性成分，主要作用于TP53、AKT1、MAPK1 等 關 鍵 靶 點，調 節MAPK、PI3K-Akt、Thyroid hormone 等多條信號通路，主要通過調控細胞增殖凋亡、抑制侵襲轉移等方面發揮抗肺癌作用。“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機制具有多成分、多靶點、多通路的特點，為臨床運用活血化瘀法治療肺癌提供理論依據。網絡藥理學方法存在局限性，它主要用于預測分析，而臨床藥效與藥物劑量、劑型及煎藥時間等多種因素有關，得到的研究結論需通過實驗進一步驗證。