可原位釋放一氧化氮的聚多巴胺納米復合物的制備及其應用

任 蓉，王 穎，王 通，修夢婷，朱利民

(東華大學 a.生物與醫學工程學院, b.上海納米生物材料與再生醫學工程研究中心, 上海 201620)

氣體治療作為一種新興的治療手段,可為攻克癌癥提供新思路。氣體治療常用的內源性活性分子主要有CO、H2S和NO等[1-5],其中NO是自然界中最小、最簡單的生物活性分子之一。研究證實,除參與調解多細胞活動[6-8]以外,NO與許多疾病的發生和發展密切相關[9-10],且高濃度的NO對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[11]。然而,由于NO在體內自由擴散迅速,半衰期短[12],常常在腫瘤部位缺乏有效積累,致使治療效果不佳。L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)作為天然的NO供體,可在誘導型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase, INOS)存在的情況下持續釋放NO。此外,L-Arg還可被活性氧(reactive oxygen species, ROS),如H2O2、單線態氧(1O2)等氧化生成NO[13-15],這為NO氣體的原位釋放提供了新思路。

由于獨特的理化性質,聚多巴胺(polydopamine, PDA)在生物醫學領域得到廣泛應用[16-18]。在弱堿性環境下,多巴胺可以自聚合,并在眾多材料表面形成PDA層。PDA的制備方法也在不斷發展和改進,這使得PDA被塑造成各種形態[19-21]。Lee等[22]開發了一種含有兒茶酚胺官能團的多巴胺表面改性技術,研究指出PDA作為外殼幾乎可以包裹在任何固體材料表面。事實上,PDA除了包覆納米顆粒(nanoparticles, NPs)以外,還可以制成納米載體。

本研究利用PDA結構與富π電子的三甲基苯(1,3,5-trimethylbenzene, TMB)分子之間的π-π堆積作用合成介孔聚多巴胺(mesoporous polydopamine, MPDA)納米顆粒,并以其為載體負載L-Arg和光敏劑IR780,制備可原位釋放NO的納米復合物。在波長為808 nm的近紅外激光(NIR)照射下,IR780可以產生1O2,1O2進而將L-Arg氧化生成NO,最終實現NO的原位釋放。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸多巴胺(DA·HCl)、Pluronic F127、羥甲基氨基甲烷(Tris)和TMB,阿拉丁生化科技股份有限公司;IR780,北京百靈威科技有限公司;無水乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、氨水、戊二醛和丙酮,國藥集團化學試劑有限公司;1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF),上海麥克林公司;維生素C(Vc),上海源葉生物科技有限公司;DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素溶液,美國賽默飛世爾科技公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT),美國Sigma公司;活性氧探針(DCFH),一氧化氮熒光探針(DAF-FM DA),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),南京凱基生物技術公司;人骨肉瘤細胞(143B),中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。所用藥品均為分析純,所用水均為超純水。

GL124-1SCN型分析天平,德國Sartorius公司;C-MAGHS10型磁力攪拌器,德國IKA公司;SCQ-5201C1型超聲波清洗機,上海聲彥超聲波儀器有限公司;FD-1 D-50型冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;Tristar 3000型全自動快速比表面積與孔隙度分析儀,美國麥克儀器公司;ZS90型馬爾文納米粒度電勢分析儀,英國馬爾文公司;UV3600型紫外可見分光光度計,日本島津公司;CLARUSSQ8-STA8000型熱重分析儀,美國珀金埃爾默公司;ADR-1860型激光器,上海熙隆光電科技有限公司;FV1000型共聚焦激光掃描顯微鏡,日本奧林巴斯公司;DMi8型倒置熒光顯微鏡,德國Leica公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MPDA的制備

將0.2 g Pluronic F127和0.2 g TMB加至50 mL含超純水和無水乙醇的混合溶液中,攪拌30 min。然后,將10 mg Tris溶解于10 mL超純水中,再加至上述混合液中。加入60 mg DA·HCl,攪拌反應24 h后,以13 000 r/min轉速離心10 min(離心半徑為6.79 cm),用體積比為2∶1的乙醇和丙酮洗滌3次,得到MPDA。最終產品于-45 ℃冷凍干燥48 h以供進一步使用。

1.2.2 精氨酸-聚多巴胺(A-MPDA)的制備

將L-Arg粉末溶于50 mmol pH=8.5的Tris緩沖液中,質量濃度為1.0 mg/mL。然后與適量的MPDA粉末混合,得到MPDA質量濃度為0.2 mg/mL的混合溶液。以300 r/min轉速攪拌溶液24 h,再經13 000 r/min轉速離心(離心半徑為6.79 cm)獲得A-MPDA,并將其超聲分散于PBS溶液中。

1.2.3 精氨酸-IR780-聚多巴胺(AI-MPDA)和IR780-聚多巴胺(I-MPDA)的制備

將30 mg IR780溶解于100 μL DMSO中,再滴加到棕黑色A-MPDA懸浮液中,避光條件下攪拌(轉速為300 r/min)過夜。以13 000 r/min轉速離心(離心半徑為6.79 cm)去除下層游離的IR780,收集洗滌后的AI-MPDA,于-45 ℃冷凍干燥48 h備用。AI-MPDA的合成示意圖如圖1所示。同時,將30 mg IR780溶解于100 μL DMSO中,再滴加到MPDA懸浮液中,避光條件下攪拌(轉速為300 r/min)過夜。以13 000 r/min轉速離心(離心半徑為6.79 cm)去除下層游離的IR780,收集洗滌后的I-MPDA,于-45 ℃冷凍干燥48 h備用。

圖1 AI-MPDA NPs的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of AI-MPDA NPs

1.2.4 IR780負載量的測定

用PBS分別配制質量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的IR780溶液,用紫外可見分光光度計在λ=780 nm處測定溶液的吸光值,并繪制IR780溶液吸光度-質量濃度標準曲線。

取1 mL未純化的AI-MPDA溶液,以13 000 r/min轉速離心5 min(離心半徑為6.79 cm),吸取上清液,并稀釋至合適的質量濃度,用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度值,再根據標準曲線計算復合物中IR780的含量。根據式(1)和(2)計算材料的載藥率L和包封率E。

(1)

(2)

式中:m0為IR780的投藥量,g;m1為上清液中IR780的質量,g;m為A-MPDA的質量,g。

1.3 材料表征

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)分析

分別吸取質量濃度為0.2 mg/mL的MPDA和質量濃度為0.2 mg/mL的AI-MPDA乙醇溶液,滴加到銅網上,自然干燥至液滴消失后繼續烘干,然后通過透射電子顯微鏡對樣品進行形貌分析。

1.3.2 穩定性分析

取質量濃度為0.5 mg/mL的MPDA和AI-MPDA水溶液,室溫下靜置24 h,觀察納米顆粒在水溶液中的聚集情況。

1.3.3 比表面積與孔隙度(BET)分析

取200 mg冷凍干燥得到的MPDA粉末,通過全自動快速比表面積與孔隙度分析儀測定樣品的比表面積與孔徑。

1.3.4 納米粒度和電勢分析

分別取經PBS溶解的質量濃度為0.5 mg/mL的MPDA、AI-MPDA溶液各2 mL,超聲處理5 min,然后分別轉移到比色皿中,用馬爾文納米粒度電勢分析儀檢測不同樣品的粒徑。

同時,利用納米粒度電勢分析儀對MPDA及其修飾物的表面電勢進行表征。分別取800 μL PBS溶解的質量濃度為0.5 mg/mL的MPDA、A-MPDA和AI-MPDA樣品置于Zeta電位樣品池,分析不同樣品的Zeta電位。

1.3.5 熱重分析

在氮氣氣氛下使用熱重分析儀,將1～5 mg樣品以10 ℃/min的速率從50 ℃加熱到600 ℃進行熱重分析。

1.3.6 UV-Vis分析

分別取PBS溶解的質量濃度為50 mg/L的L-Arg、MPDA NPs、IR780、AI-MPDA NPs溶液各800 μL,超聲5 min使其充分溶解,然后分別轉移到比色皿中,通過UV-3600型紫外可見分光光度計于200～1 000 nm波長區間檢測樣品的紫外吸收值。

1.4 AI-MPDA的體外細胞攝取

將143B細胞接種于35 mm共聚焦培養皿中,并在37 ℃、體積分數為5%的CO2環境中培養24 h。設置4組試驗,即對照組PBS、IR780、AI-MPDA NPs、AI-MPDA NPs+NIR(近紅外激光照射)。用未添加FBS的DMEM培養基培養4 h(其中AI-MPDA NPs+NIR組在培養2 h后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再培養2 h),然后去掉培養基,用PBS溶液洗滌兩次。用戊二醛溶液在4 ℃下固定細胞,15 min后吸棄戊二醛溶液,用PBS溶液洗滌兩次,在黑暗中用DAPI染色液染色5 min,再用PBS溶液洗滌3次,通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)記錄圖像。

1.5 AI-MPDA的體外ROS生成

將143B細胞接種于6孔板,并在37 ℃、體積分數為5%的CO2環境中培養24 h。設置4組試驗,即對照組PBS、IR780+NIR、I-MPDA+NIR和AI-MPDA+NIR。將PBS溶液及其溶解的藥物添加到每個孔的培養基中,持續孵育4 h。吸去藥物溶液后,每孔加入1 mL配置好的DCFH染液。于37 ℃溫育20 min(其中NIR組在溫育10 min后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再溫育5 min),然后吸去染色液,采用PBS溶液洗滌3次,通過倒置熒光顯微鏡記錄圖像。

1.6 AI-MPDA的體外NO生成

將143B細胞接種于6孔板,并在37 ℃、體積分數為5%的CO2環境中培養24 h。設置4組試驗,即對照組PBS、A-MPDA NPs+NIR、AI-MPDA NPs+NIR和AI-MPDA NPs+Vc+NIR。將PBS溶液及其溶解的藥物添加到每個孔的培養基中,持續孵育4 h。吸去藥物溶液后,每孔加入1 mL配置好的DAF-FM DA染液。然后于37 ℃溫育20 min(其中NIR組在溫育10 min后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再溫育5 min),然后吸去染色液,使用PBS溶液洗滌3次,通過倒置熒光顯微鏡記錄圖像。

2 結果與討論

2.1 材料的制備及性質

2.1.1 MPDA和AI-MPDA的TEM分析和穩定性分析

MPDA和AI-MPDA的TEM圖如圖2所示。由圖2(a)可以看出,MPDA具有較為均勻的球形形貌和不規則的介孔結構,肉眼觀察到其粒徑約為180 nm;由圖2(b)可以看出,AI-MPDA的介孔結構逐漸變得模糊,粒徑略微增大,約為200 nm,說明成功合成納米顆粒。此外,將MPDA和AI-MPDA的水溶液靜置24 h后,均沒有觀察到明顯的聚集現象(見圖3),說明制備的納米顆粒具有良好的分散性和穩定性。

圖2 MPDA和AI-MPDA的TEM圖像Fig.2 TEM images of MPDA and AI-MPDA

圖3 MPDA和AI-MPDA在水中的數碼照片Fig.3 Digital photos of the MPDA and AI-MPDA in water

2.1.2 MPDA的BET分析

MPDA的氮氣吸附-脫附曲線和孔徑分布曲線如圖4所示,其中,圖4(b)縱軸標題中的r=dV/dD。由圖4(a)可知,MPDA的氮氣吸附-脫附曲線為典型的Ⅳ型等溫線,表明存在介孔。此外,由圖4(b)可知,MPDA在9～80 nm內存在較寬的孔徑分布。這是因為納米顆粒的孔徑分布不規則,且在合成的過程中產生了大小不規則的空腔。制備的MPDA納米顆粒的比表面積為40.80 m2/g,總孔容為0.44 cm3/g。

圖4 MPDA的氮氣吸附-脫附等溫曲線和孔徑分布Fig.4 Nitrogen adsorption and desorption isothermal curve and pore size distribution of MPDA

2.1.3 MPDA和AI-MPDA的粒徑和電勢分析

MPDA和AI-MPDA的粒徑分布如圖5所示。由圖5可知,制備的MPDA納米載體的粒徑約為180 nm。經過一系列修飾后,AI-MPDA的粒徑略大于MPDA,約為200 nm,能通過腫瘤的高滲透強滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應,促使AI-MPDA在腫瘤部位聚集。

圖5 MPDA和AI-MPDA的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of MPDA and AI-MPDA

通過Zeta電勢的變化來驗證納米顆粒的制備結果。MPDA、A-MPDA和AI-MPDA的表面電勢如圖6所示。由圖6可知,MPDA的電勢約為-24.6 mV,加入L-Arg后,A-MPDA的電勢變為-10.6 mV,負載IR780后的電勢較A-MPDA升高了約3 mV。電勢的變化表明成功制備出AI-MPDA納米顆粒。

圖6 MPDA、A-MPDA和AI-MPDA的表面電勢Fig.6 Zeta potential of MPDA, A-MPDA and AI-MPDA

2.1.4 IR780、L-Arg的負載和UV-Vis分析

證實成功合成MPDA后,利用納米載體進行載藥。將載藥試驗得到的上清液中的IR780的吸光值代入到IR780標準曲線(y=0.040 3x+0.155 1,R2=0.999 3)中求IR780的負載量,再將IR780負載量代入式(1)和式(2),計算得出載藥率為19.88%、包封率為99.00%。

MPDA和A-MPDA的熱重分析曲線如圖7所示。MPDA加熱到600 ℃時失重率為45.7%,而A-MPDA加熱到600 ℃時的失重率為53.2%。這主要歸功于L-Arg發生的熱解反應。證實L-Arg成功負載在MPDA上。計算得出L-Arg的負載率約為7.5%。

圖7 MPDA和A-MPDA的熱重分析曲線Fig.7 TGA curves of MPDA and A-MPDA

MPDA、L-Arg、IR780和AI-MPDA的紫外-可見光吸收光譜如圖8所示。由圖8可知,在600～800 nm處出現游離IR780的特征吸收峰,相應地,AI-MPDA在700～900 nm處有較寬的吸收峰。IR780的典型吸收峰位于740和810 nm處,這可歸因于IR780聚集體形成的紅移現象[23],說明成功制備得到AI-MPDA納米顆粒。

圖8 MPDA、L-Arg、IR780和AI-MPDA的紫外-可見光吸收光譜Fig.8 UV-Vis absorption spectra of MPDA, L-Arg, IR780 and AI-MPDA

2.2 AI-MPDA NPs的體外細胞攝取

為了評估143B細胞對納米顆粒的攝取情況,通過CLSM記錄細胞內的IR780熒光強度,結果如圖9所示。由圖9可知,與游離IR780治療時的微弱紅色熒光相比,經AI-MPDA孵育后,143B細胞的IR780紅色熒光顯著增強,說明IR780標記的納米顆粒很多被143B細胞內化。這可能是因為MPDA的兒茶酚基團會增強細胞對納米顆粒的攝取[24]。此外,AI-MPDA+NIR組的紅色熒光最明顯,說明近紅外激光照射增強了細胞對AI-MPDA的攝取。這可能是由于激光照射下MPDA產生的高溫對細胞膜造成了輕微損傷,增強了細胞攝取效應[25]。

圖9 143B細胞的倒置熒光顯微圖像Fig.9 Inverted fluorescence microscopic image of 143B cell

2.3 ROS的體外生成

以DCFH為探針,通過倒置熒光顯微鏡檢測細胞內的ROS含量,以評估AI-MPDA在細胞內的ROS生成情況,結果如圖10所示。由圖10可知,與游離IR780共孵育4 h后,在143B細胞中只觀察到微弱的熒光,與細胞攝取的結果一致。這是因為細胞對游離IR780的攝取較少。I-MPDA在激光照射下的熒光強度明顯強于AI-MPDA,這是由于在L-Arg參與的NO生成反應中消耗了ROS。

圖10 143B細胞的DCFH熒光顯微圖像Fig.10 DCFH fluorescence microscopic image of 143B cell

2.4 NO氣體的體外生成

以DAF-FM DA為熒光探針,通過倒置熒光顯微鏡檢測細胞內的NO含量,評估AI-MPDA在細胞內的NO生成情況,結果如圖11所示。由圖11可知,經AI-MPDA+NIR治療后,細胞中的熒光強度最強,表明AI-MPDA在細胞內的NO釋放效率最高。值得注意的是,用還原劑Vc清除PDT效應產生的ROS后,細胞中的熒光強度明顯減弱。這表明細胞中的NO是通過轉化ROS產生的。該結論與AI-MPDA組的ROS結果相一致。

圖11 143B的DAF-FM DA熒光顯微圖像Fig.11 DAF-FM DA fluorescence microscopic image of 143B

3 結 語

采用模板法制備介孔聚多巴胺納米載體顆粒,并負載L-Arg和IR780,構建了精氨酸-IR780-聚多巴胺納米顆粒。透射電子顯微圖像和比表面積分析表明,該納米復合物具有較規則的形貌和較大的比表面積。體外細胞試驗表明,介孔聚多巴胺納米載體可以被143B腫瘤細胞攝取,并能通過將活性氧轉化為NO實現NO氣體的腫瘤原位釋放,是一種具有潛力的納米遞送系統。