天冬氨酸?；D(zhuǎn)移酶及其相關(guān)疾病的研究進(jìn)展*

張穎貞,王一丹,王培昌 綜述,付靜軒 審校

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100053

N-乙酰-L-天冬氨酸(NAA)是由神經(jīng)元產(chǎn)生的天冬氨酸衍生物,是大腦中含量第二高的氨基酸/氨基酸衍生物,僅次于含量第一位的谷氨酸。NAA代謝通過影響水的運(yùn)輸、髓鞘合成、神經(jīng)細(xì)胞能量代謝等方面進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能,NAA增多或減少均會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。天冬氨酸?；D(zhuǎn)移酶(ASPA)是將NAA分解為天冬氨酸和乙酸鹽的酶,在維持NAA代謝平衡過程中發(fā)揮重要作用。ASPA突變可導(dǎo)致罕見病卡納萬病(CD),CD預(yù)后極差。此外,近些年關(guān)于甲基化ASPA基因在衰老預(yù)測(cè)模型中的報(bào)道逐漸增多,提示了ASPA在神經(jīng)系統(tǒng)之外的作用。本文將對(duì)ASPA的生物學(xué)功能、ASPA突變所致CD的臨床癥狀及治療,以及甲基化ASPA基因在衰老中的作用進(jìn)行綜述。

1 ASPA及其底物NAA的生物學(xué)作用

ASPA在大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá),其作用是催化腦組織中NAA為天冬氨酸和乙酸鹽[1]。ASPA基因位于染色體17p13.2上,由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。ASPA由313個(gè)氨基酸構(gòu)成,其相對(duì)分子質(zhì)量大小為36.7×103,ASPA在腎組織中表達(dá)最高,其次是腦組織、脂肪組織、小腸等。在腦組織中,ASPA在白質(zhì)束和丘腦中表達(dá)最多。細(xì)胞水平上,ASPA僅在白質(zhì)和灰質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)部分表達(dá),而細(xì)胞膜部分不表達(dá)[2]。ASPA在物種進(jìn)化過程中是保守的,ASPA及其底物NAA在正常大腦生物學(xué)功能中起著重要作用。

NAA是一種由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的天冬氨酸衍生物,是大腦中含量第二高的氨基酸/氨基酸衍生物,僅次于含量第一位的谷氨酸。NAA在腦組織中表達(dá)豐富,而在其他組織中含量極少。目前常用的檢測(cè)方法為磁共振波譜分析(MRS)。在神經(jīng)細(xì)胞線粒體中,天冬氨酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Asp-NAT)由NAT8L基因編碼,負(fù)責(zé)將天冬氨酸和乙酰輔酶A合成為NAA,與負(fù)責(zé)降解NAA的ASPA不同,Asp-NAT只在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá),而ASPA在多種組織中均有表達(dá)。NAA在神經(jīng)細(xì)胞線粒體合成后,通過二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),最終轉(zhuǎn)運(yùn)至少突膠質(zhì)細(xì)胞由ASPA降解。鈉依賴性二羧酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(NaDC3)參與NAA進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)輸[3]。NAA和ATP代謝間接相關(guān),NAA在神經(jīng)元線粒體能量代謝中起著不可或缺的作用[4]。NAA也是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中第三大神經(jīng)遞質(zhì)N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(NAAG)的前體[5-6]。NAA在出生后發(fā)育期間對(duì)脂質(zhì)合成至關(guān)重要。NAA代謝產(chǎn)生的乙酸鹽用于乙酰輔酶A的合成從而參與髓磷脂的合成。因此,由NAA代謝障礙導(dǎo)致乙酸鹽供應(yīng)不足將導(dǎo)致髓磷脂合成缺陷[7]。NAA可以反映神經(jīng)細(xì)胞功能,被視為神經(jīng)細(xì)胞健康的標(biāo)志物,有研究報(bào)道,正常衰老過程中隨著年齡增加NAA的水平隨之減少[8]。NAA水平與多種神經(jīng)疾病密切相關(guān),在阿爾茨海默病、癲癇、精神分裂癥、多發(fā)性硬化癥中NAA水平降低,而在罕見病CD中,NAA水平相對(duì)升高,CD患者腦組織中NAA水平比正常水平高30%,尿液、血漿和腦脊液中NAA水平比正常水平高出300倍[9]。

2 ASPA突變所致疾病CD

CD是一種致命的兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病。由NAA代謝障礙導(dǎo)致的髓鞘合成障礙和白質(zhì)病變?yōu)镃D特征性改變。目前,CD是與ASPA基因突變關(guān)系最為密切的一種疾病。ASPA基因突變包括錯(cuò)義/無義、剪接、缺失和插入[10]。當(dāng)ASPA突變后,其酶活性降低或含量減少,不能將具有神經(jīng)毒性的NAA充分水解,致使NAA在尿液、血漿、腦組織中聚集,使大腦發(fā)生海綿狀變性、脫髓鞘以及運(yùn)動(dòng)功能缺陷,最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常[11-12]。CD是一種常染色體隱性遺傳病,伴隨神經(jīng)退行性改變,常見于德系猶太人群,發(fā)病率為1/6 400至1/13 500,每40～58例德系猶太人中就有1例是攜帶者[13]。在非猶太患者中,CD是最常見的遺傳性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良[14]。在普通人群中,CD的發(fā)病率為1/100 000[15]。而我國(guó)關(guān)于CD的報(bào)道較少。

2.1CD的臨床表現(xiàn) CD普遍在嬰兒時(shí)期發(fā)病,表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力障礙和發(fā)育遲緩[16]。CD的早期癥狀包括易怒和頭部控制不良的肌張力減退。通常,發(fā)育遲緩和大頭畸形在6個(gè)月后變得明顯。盡管有嚴(yán)重的發(fā)育遲緩,CD患兒有時(shí)可以與他人互動(dòng)、微笑、伸手拿東西。CD患兒后期發(fā)展為視神經(jīng)萎縮和視網(wǎng)膜退化、軸索張力持續(xù)減退、手臂和腿部的張力減退轉(zhuǎn)變?yōu)橹w僵硬和痙攣。隨著年齡的增長(zhǎng),患兒變得越來越虛弱,經(jīng)常發(fā)生癲癇,無法移動(dòng)或自主吞咽[17]。典型CD的長(zhǎng)期預(yù)后仍然很差,通常在青春期之前死亡,而一些病情較輕的患者則能活過20歲。

2.2CD的病理機(jī)制 目前,研究人員正在使用小鼠模型研究CD中白質(zhì)變性或髓鞘損傷的機(jī)制,并就CD的病理生理學(xué)提出了幾個(gè)假說。一種假說是NAA分解代謝紊亂導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞水腫。NAA可以作為分子水泵,通過被ASPA水解成醋酸鹽和天冬氨酸來去除神經(jīng)元中的代謝水,當(dāng)不斷積累的NAA不能被ASPA水解時(shí),神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞水腫,細(xì)胞外液滲透壓失衡[18]。另一種假說是合成髓磷脂所必需的醋酸鹽是通過ASPA水解NAA提供的。因此,由NAA代謝障礙導(dǎo)致乙酸鹽供應(yīng)不足將導(dǎo)致髓磷脂合成缺陷[7]。還有一種假說是,NAA代謝過程中產(chǎn)生的乙酰輔酶A既可通過影響脂肪酸合成最終影響髓鞘形成,也可通過影響ATP形成參與能量代謝[19-20]。然而,CD的發(fā)病機(jī)制不僅涉及NAA代謝紊亂,還涉及少突膠質(zhì)細(xì)胞中NAA相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)過程[21-23]?？傊?與許多其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病類似,多種機(jī)制共同參與CD的病理過程。

2.3CD的診斷 目前,CD的檢測(cè)方法主要包括尿NAA水平、腦磁共振成像(MRI)和測(cè)序等。CD患者尿NAA水平明顯高于健康者,通常是健康者的100多倍,而其他白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良病例中,NAA水平只是略有升高(約4～ 6倍)。因此,與其他白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良相比,NAA明顯升高對(duì)CD診斷更具有特異性,檢測(cè)尿NAA水平有助于診斷CD[9]。MRI在CD診斷中同樣起重要作用。CD的MRI表現(xiàn)為彌漫性白質(zhì)受累,主要位于皮質(zhì)下區(qū)域、基底神經(jīng)節(jié)和橋腦背側(cè)[24]。CD在MRI也有一些非典型、罕見的特征,如多囊外觀,篩狀外觀[25-26]。NAA峰值升高、NAA/肌酐升高以及NAA/膽堿升高是CD在磁共振波譜(MRS)中的特征表現(xiàn)[24]。此外,全外顯子組測(cè)序可幫助CD診斷,特別是對(duì)缺乏特定表型的患者。有研究對(duì)1例疑似CD的先證者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序,通過先證者及其父母和兄弟的Sanger測(cè)序?qū)蜻x變異進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明ASPA基因的復(fù)合雜合變異可能是該患者CD病的基礎(chǔ)[27]。

2.4CD的治療 CD的治療主要是對(duì)癥治療,可以分為基因治療和藥物治療。

2.4.1CD的基因治療 鑒于CD是由ASPA缺乏引起的,ASPA基因替代療法或降低NAT8L基因的表達(dá),恢復(fù)功能性ASPA的表達(dá),有望治療CD。注射含有ASPA基因的重組腺相關(guān)病毒顆粒[28-29]、敲除NAT8L[30-32]均可以降低大腦中升高的NAA水平。有研究聯(lián)合以上兩種基因療法,在CD小鼠中進(jìn)行了研究,結(jié)果表明聯(lián)合療法可以使CD小鼠腦質(zhì)量空泡減少并長(zhǎng)期逆轉(zhuǎn)CD小鼠所有病理特征,包括體重減輕、運(yùn)動(dòng)障礙、NAA水平升高、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和脫髓鞘[33]。此外,敲除編碼NaDC3的SLC13A3基因后,CD小鼠大腦中的NAA水平完全正常化,阻止了小腦和丘腦空泡化,并顯著改善了運(yùn)動(dòng)性能[3]。

近年來,誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPSC)、反義寡核苷酸也被用于CD的治療。通過慢病毒轉(zhuǎn)染或CRISPR / Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)將野生型ASPA基因引入患者iPSC中,然后分離出表達(dá)野生型ASPA基因的神經(jīng)祖細(xì)胞,證明所得神經(jīng)祖細(xì)胞具有ASPA酶活性后進(jìn)行移植。移植的ASPA野生型神經(jīng)祖細(xì)胞能夠在CD小鼠大腦中存活,并重建了CD小鼠大腦中ASPA的活性,降低了腦組織和腦脊液中的NAA水平,并使CD小鼠標(biāo)志性病理表型,如腦海綿變性、髓鞘形成缺陷和運(yùn)動(dòng)功能障礙有所改善[34]。iPSC技術(shù)為CD治療提供了新思路。反義寡核苷酸是RNA或DNA的一小段單鏈分子,與特定的mRNA序列結(jié)合,改變mRNA剪接,從而修飾所得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或抑制翻譯,從而降低蛋白質(zhì)表達(dá)[35]。有研究證明,通過向年輕成年ASPA缺陷小鼠注入反義寡核苷酸來抑制NAA合成,可以逆轉(zhuǎn)其先前存在的共濟(jì)失調(diào)并減少小腦和丘腦空泡和浦肯野細(xì)胞樹突狀萎縮[36]。

最近,利用慢病毒和重組腺相關(guān)病毒(AAV)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)定向基因治療取得了成功,并已嘗試進(jìn)行臨床試驗(yàn)[28,37]。目前的研究表明,這種方法需要進(jìn)一步優(yōu)化,最近的研究重點(diǎn)是新型AAV載體和靶向治療少突膠質(zhì)細(xì)胞[29]。這些新方法可能使ASPA基因治療成為現(xiàn)實(shí)。

2.4.2CD的藥物治療 CD的藥物治療主要集中在降低腦NAA水平、降低NAA相關(guān)的氧化應(yīng)激、改善滲透壓失調(diào)或增加乙酰輔酶A和脂質(zhì)合成。

(1)降低腦NAA水平。降低ASPA缺乏癥中的腦NAA水平,可以通過阻斷神經(jīng)元合成或釋放NAA、阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞/少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)NAA的攝取等途徑。Asp-NAT抑制劑可以通過減少NAA的合成,降低腦NAA水平。Zn2+是Asp-NAT活性的直接濃度依賴性抑制劑,但Zn2+在CD中的治療作用尚未進(jìn)行評(píng)估[38]。NaDC3抑制劑可以通過阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞/少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)NAA的攝取,降低腦NAA水平。二羧酸鹽,如琥珀酸鹽、α-酮戊二酸和富馬酸鹽以及檸檬酸三羧酸鹽能顯著抑制NAA吸收[39]。然而,二羧酸鹽不能通過血腦屏障,因此需要鑒定和開發(fā)新型可通過血腦屏障的NaDC3抑制劑或者通過鼻內(nèi)給藥繞過血腦屏障來提高生物利用度來進(jìn)一步驗(yàn)證并提高療效。活性ASPA的酶替代療法也可以降低腦NAA水平[40]。(2)降低NAA相關(guān)的氧化應(yīng)激。硫辛酸是一種已知能穿過血腦屏障的抗氧化劑。在NAA給藥前,硫辛酸預(yù)處理2 d,可以阻斷急性NAA給藥引起的大鼠氧化應(yīng)激的所有癥狀[41]。這些結(jié)果提示補(bǔ)充抗氧化劑是一種治療CD的方法,但抗氧化劑在CD動(dòng)物模型和患者中的作用仍有待進(jìn)一步研究。(3)改善滲透壓失調(diào)。托吡酯是一種抗癲癇藥物,能有效治療成人和兒童廣泛的癲癇類型。在兩例6個(gè)月大的CD患者中使用托吡酯治療,分別在7個(gè)月和15個(gè)月的隨訪中顯示頭部生長(zhǎng)速度下降[42]。然而,其作用機(jī)制尚不清楚。(4)增加乙酰輔酶A和脂質(zhì)合成。增加腦乙酸鹽和乙酰輔酶A水平可以為CD治療提供益處。三乙酸甘油(GTA)是一種短鏈三酰甘油,可以作為乙酸前體。GTA方案治療約120 d的CD大鼠大腦和脊髓中的空泡適度減少、髓磷脂增加、運(yùn)動(dòng)性能顯著改善[43]。但是GTA治療并沒有緩解CD嬰兒的癥狀[44]。甘油三庚酸(GTH)是一種合成的三酰甘油。GTH衍生物轉(zhuǎn)化后可增加脂質(zhì)合成。新生Nur7小鼠(CD模型小鼠)膳食中補(bǔ)充GTH可增加大腦中的髓磷脂,減少氧化應(yīng)激,促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期存活,改善小鼠腦海綿狀變性和運(yùn)動(dòng)功能[45]。然而,GTA和GTH治療在臨床前和臨床研究中僅部分有效,對(duì)于CD患者,GTA和GTH治療效果仍有待檢驗(yàn)。白藜蘆醇通過影響CD患者成纖維細(xì)胞中的ASPA和參與髓鞘形成的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄程序的POU3因子的表達(dá),可能對(duì)CD患者有益[46]。

由于CD的發(fā)病過程中存在多種機(jī)制,聯(lián)合使用Asp-NAT抑制劑、聚乙二醇修飾的ASPA和GTH膳食補(bǔ)充劑,可以通過抑制Asp-NAT和增加ASPA活性來降低腦NAA水平,提高大腦乙酸水平,增加乙酰輔酶A的形成從而使CD患者獲得更好的治療效果[15]。

3 小 結(jié)

近些年來,利用多種基因甲基化標(biāo)志物構(gòu)建年齡預(yù)測(cè)模型的研究逐漸成為熱點(diǎn),并初步應(yīng)用于法醫(yī)領(lǐng)域。諸多研究表明,ASPA基因甲基化程度隨年齡下調(diào),ASPA基因不同CpG位點(diǎn)甲基化程度是多種年齡預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)因子[47-50]。ASPA基因甲基化程度在衰老領(lǐng)域的研究提示了ASPA在神經(jīng)系統(tǒng)之外的作用,但目前鮮見相關(guān)報(bào)道。

綜上所述,ASPA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用,通過降解重要氨基酸衍生物NAA維持其代謝平衡,保障神經(jīng)系統(tǒng)水的運(yùn)輸、髓鞘合成、神經(jīng)細(xì)胞能量代謝等功能的正常運(yùn)行。當(dāng)ASPA突變導(dǎo)致其酶活性降低時(shí),會(huì)引起罕見疾病CD,CD目前預(yù)后及其不良,沒有有效治療方法,研究人員試圖通過基因療法緩解該病,但效果欠佳,且多數(shù)研究停留在動(dòng)物層面。在治愈CD方面還需更加深入的研究。此外,近些年關(guān)于ASPA基因甲基化在衰老預(yù)測(cè)模型中的報(bào)道逐漸增多,提示了ASPA在神經(jīng)系統(tǒng)之外的作用,但具體發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)一步研究。