唾液酸結合性免疫球蛋白凝集素6的生物信息學分析及多克隆抗體制備

王晨陽,徐 鵬,魏墨林,張 瑋,曹海濤

1.中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫院中心實驗室,河北保定 071000;2.中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫院衛勤處,河北保定 071000;3.保定市人民醫院健康管理中心,河北保定 071000;4.中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫院門診部,河北保定 071000

唾液酸結合性免疫球蛋白凝集素(Siglec)一般是在免疫系統的細胞上表達[1],由于其唾液酸配體的特異性,Siglecs呈現多樣化的特性,并且,表達在天然免疫細胞上的Siglecs大多數都是抑制性受體,通過對有關損傷模式分子(DAMPs)和病原體的相關模式分子(PAMPs)的調控來影響炎癥反應,這個分子譜系含有許多與黏附及吞噬有關的分子,以及與含有DAP12轉換子的酪氨酸依賴性活化基序(ITAM)相關受體,Siglecs可以通過連接表達在同樣細胞上的順式配體和對唾液酸糖結合物衍生的病原體起反應,從而發揮抑制免疫細胞的功效[2]。它們可以幫助維持B淋巴細胞的耐受能力,并對常規DC前體和類漿細胞的DC前體前體的激活進行調控[3],通過直接或間接的方式調節T細胞的功能[4],Siglecs通過影響免疫系統中的每一個細胞來調節免疫反應,與健康和疾病是密切相關的。

對于Siglec-6的基因結構和生物學功能,目前國內外所知甚少。本文通過對Siglec-6結構、基本物理化學性質、功能分類和抗原表位的分析,提出了一種新型的多肽抗原免疫新西蘭兔方法,為進一步研究Siglec-6創造條件,生產出 Siglec-6蛋白的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1主要材料來源 新西蘭兔(2 kg,購自從軍事醫學科學院的動物中心);血藍蛋白(KLH)、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)、戊二醛(購自西格瑪公司),弗氏全佐劑和不全佐劑;牛血清清蛋白(BSA)、甘氨酸(Glycine)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(Vector公司);抗體親和層析試劑盒(PIERCE公司);本實驗室構建生產TK-4T1融合蛋白;預染蛋白相對分子質量的標準試劑采購自德國Fermentas公司(MBI);PVDF膜(德國Schleicher &Schuell公司);化學發光試劑(ECL)從PIERCE公司采購。

1.2生物信息分析過程 登錄NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),利用“protein blast”方法對Siglec-6序列(NP_001236)進行同源性檢索。采用Geneious軟件和Lasergene軟件分別對Siglec-6的蛋白質二級結構、抗原特異性、親疏水性、與其他分子的結合位點、氨基酸組成的負荷帶電屬性等物理化學性質進行分析;用NCBI數據庫Blast分析及Geneious軟件進行同源性比較;用Lasergene軟件對Siglec-6蛋白進行功能和分類預測。

1.3Siglec-6的設計與免疫原及包被原的合成 Siglec-6位于人類第19號染色體19q13.3上,本文根據同源性、抗原性、親疏水性等因素進行分析,分別設計了位于N端和C端的兩個多肽,多肽合成和純化由北京華大蛋白質研發中心有限公司采用固相多肽合成法合成,經質譜鑒定和高效液相色譜(HPLC)純化,純度為98.0%。

1.4Siglec-6多克隆抗體的制備及純化 取200 μg的多肽免疫原,用0.9%的NaCl注射液稀釋至200～500 μL,然后添加等體積弗氏佐劑(初次免疫用弗氏全佐劑,加強免疫用弗氏不全佐劑),將溶液和佐劑用混合設備混合均勻,從而形成油包水。將攪拌好的多肽免疫原在日本大耳白兔的背部選取8～10個點進行皮膚下注射。在首次免疫之后的第4周進行第一次加強免疫,之后每隔2周進行加強免疫1次,共完成加強免疫3次。最后一次免疫后的第7天,采用耳緣靜脈取血,經過ELISA測定加強免疫后的抗體效價,在達到理想的抗體效價后,從新西蘭兔的頸動脈采血,用采集到的血清進行親和層析分離純化,將純化的抗體進行分裝,保存到-70 ℃的超低溫冰箱待用。

1.5Siglec-6多克隆抗體的效價測定 用包被液對抗原進行稀釋(多肽偶聯BSA),使其濃度達到2 μg/mL,每孔加入100 μL,4 ℃,孵化過夜,洗液沖洗2次。之后用封閉液進行封閉,每孔加入200 μL,37 ℃溫箱孵育2 h;再用洗液沖洗1次。兔的多抗血清從200倍稀釋濃度開始以2倍濃度的梯度進行稀釋(in PBS),陰性對照(negative)為未免疫的兔血清進行200倍稀釋(in PBS),空白對照(blank)是PBS;每孔加入100 μL,37 ℃溫箱孵育1 h,洗液沖洗3次。然后加入稀釋后的二抗(用 PBS稀釋20 000倍),每孔加入100 μL,37 ℃溫箱孵育1 h,之后取出,再用洗液沖洗3次。進行顯色,每孔加入100 μL顯色液,顯色5～15 min。每個樣品孔中添加入50 μL顯色終止液,完成終止。用吸光光度計在波長(450～630)nm下測量吸光度(A),保存并記錄數據資料,進行作圖深入分析。效價值為大于最大A值50%的A值最小讀數對應的稀釋度值。

1.6檢測Siglec-6多克隆抗體特異性 首先對Siglec-6多克隆抗體進行純化,然后針對293T融合表達的Siglec-6蛋白進行Western blotting檢測以鑒定多克隆抗體的特異度。

2 結 果

2.1氨基酸序列相似性比對 在NCBI上檢索Siglec-6(NP_001236),同時檢索到同源序列rhSiglec-3、 rhSiglec-5、rhSiglec-9、rhSiglec-10、 rhSiglec-7、rhSiglec-11。用NCBI蛋白數據庫Blast分析Geneious軟件對Siglec-6及其同源蛋白序列進行比對,結果顯示,同源序列之間相似性非常高,本文根據比對序列選取差異區域的3組序列:Pep-1為ERRFQLEGP,Pep-2為VQNTDDVNPVMV,Pep-3為VQPQEPKVTDT。同時,Geneious軟件和Lasergene軟件分析Siglec-6親疏水性抗原性、表面可及性及二級結構可知,本文選擇的3條多肽都可以作為抗原表位。

2.2多肽抗體的制備和效價 由于Pep-2和Pep-3都位于N端,本文選取Pep-1和Pep-3作為Siglec-6的多肽抗原序列,將設計的多肽序列合成后分別與KLH交聯,并分別免疫新西蘭兔,之后取血清進行倍比稀釋,ELISA測定Pep-1效價為1∶51 200,Pep-3效價為1∶12 800,表明兩組都獲得高效價的多抗。采用親和層析技術對抗血清進行純化。

2.3對Siglec-6多克隆抗體特異度進行檢測 為測定血清抗體的特異度,筆者把經過純化后的抗體進行稀釋,稀釋濃度1∶1 000,然后進行Western blotting檢測,對印跡分析(參見圖1),結果表明,在轉染后首次抽取的293T細胞蛋白組分中,所使用的多克隆抗體的特異性均可探測到單個相對分子質量為90×103的陽性染色條帶(參見圖1),結果表明,制備的多克隆抗體在293T細胞中轉染48 h后,均可檢測到單一的相對分子質量為90×103的陽性染色條帶,與GFP-S6蛋白相對分子質量的理論值相符,而免疫前陰性血清在轉染后48 h提取的293T細胞蛋白組分中未檢測到對應的條帶,說明獲得了特異度較好的抗Siglec-6多克隆抗體。

3 討 論

使用互聯網的核酸和蛋白質數據庫,對功能尚不明確的一些基因所編碼的蛋白質的結構和功能進行深入的分析和預測,目前已成為探索蛋白質結構和功能的一種高效便捷的手段。有研究表明,在特定條件下,通過數據庫和軟件預測得到的蛋白質結構和功能和實驗測定的結果相一致[5]。這些生物信息學方法在基因辨識、推測蛋白質生物功能、確定蛋白質的生理范圍、預測蛋白質多維結構等方面都具有十分重要的作用。本文利用這些高效的方法,來對Siglec-6的抗原特異性、跨膜結構域、高級結構、親疏水性、結合特異位點、氨基酸序列的正負電屬性、所選擇氨基酸偏移的酸堿性,以及合成多肽的難易等進行了綜合分析[6]。本文對以上因素進行充分評估后,確定了針對Siglec-6不同表位的兩條多肽,制備了針對Siglec-6不同表位的多克隆抗體。由于合成的多肽經過純化后純度高達98.0%,且靶向Siglec-6表位的C端和N端,可能具有較高的效價和純度,并且具有較強的特異度。

獲得多肽抗體后,對該多抗的特異度和反應度進行了檢測。除了抗體的效價外,還有另外一個檢驗抗體質量的重要標準,就是制備的抗體在不同條件下與抗原的結合能力。有些肽段形成的抗原決定簇在特殊條件下會受到變性和破壞,因此針對這些特殊肽段的抗體不會用Western blotting方法進行檢測。本研究的結果顯示,制備的Siglec-6多肽抗體可以用Western blotting成功的檢測到(圖1),說明本文制備的抗體在不同條件下的抗原結合能力均能滿足通常的實驗要求。

人體的大量Siglecs表達在B細胞上包括Siglec-2、5、6、9、10[7],在艾滋病患者中,衰竭的B細胞高表達很多抑制型受體,包括Siglec-6。用siRNA敲除可以下調Siglec,能使B細胞功能恢復[8]。雖然Siglec-2/CD22 knockout和knockin小鼠在最近幾十年得以廣泛的研究,但是經常得到相互矛盾的結論,因此Siglecs在B細胞中的功能還沒有定論。對突變小鼠的研究表明,Siglec/SIAE/Lyn/SHP-1路徑對B細胞耐受和防止自身免疫都起著積極作用[9]。唾液酸乙酰酯酶在疾病中很少出現遺傳性變型,揭示了它可以避免人類的自身免疫和慢性炎癥混亂[10],但是其在細胞中的生化功能仍然不完全了解。

對Siglecs的研究進一步證實了Siglec-6可能在感染和免疫疾病的診斷和治療中發揮重要作用,具有廣闊的應用前景。這也說明了Siglec-6單克隆抗體和多克隆抗體等相關產品的開發具有潛在的應用價值。綜上所述,采用合成多肽技術,對不同 Siglec-6表位的多克隆抗體進行制備,不但提供了一種簡單、高效的方法,而且為Siglec-6相關產品的開發以及Siglec-6相關的基礎和臨床研究提供了一定的實驗依據。