鐵元素在抗銅綠假單胞菌生物膜感染中應用進展*

崔亞斌 綜述,沈 娜,蘇衛東△ 審校

天津市第四中心醫院:1.檢驗科;2.中心實驗室,天津 300140

銅綠假單胞菌(PA)是由世界衛生組織(WHO)提出必須迅速開發的新抗菌藥物廣泛清單上最優先病原體ESKAPE(屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、PA、腸桿菌屬)的成員之一,其對生存環境變化具有很強的遺傳靈活性和生理適應性,表現在對抗菌藥物耐受性增強(MDR-PA、XDR-PA、PDR-PA、CR-PA)、細菌生存方式改變(生物膜形成)以及細菌表型改變(小菌落變異株、黏液型菌株)[1]。PA通過分泌黏性和保護性基質,菌體以群體的形式存在于胞外聚合物(EPS)中,形成“生物膜”。生物膜形成能幫助PA實現免疫逃逸和(或)增強抗菌藥物耐受性[2];另外生物膜內細菌細胞的最小抑菌濃度(MIC)可能比浮游狀態高10～10 000倍[3],因此一旦生物膜形成,臨床感染就很難根除。

宿主感染期間,宿主通過“營養免疫”來限制PA對鐵的攝取。作為回應,菌細胞能分泌鐵載體、還原血紅素等機制獲取鐵,以滿足生存需要。鐵爭奪戰是宿主-病原體相互作用中的一個重要過程,病原體獲得這種金屬的有效性可以決定感染的成敗。因此,阻斷鐵獲取正成為預防和/或治療PA感染的一種新策略。本文僅就鐵元素在PA生物膜發生發展及抗生物膜感染的新進展做以下綜述。

1 PA的鐵攝取系統

PA通過多種鐵攝取系統來獲取鐵元素:(1)鐵載體系統;(2)血紅素系統;(3)Feo和BqsR/BqsS雙組分的Fe2+攝取系統;(4)PQS系統介導鐵攝取;(5)鐵穩態調節。

1.1鐵載體系統 鐵載體是PA最主要的鐵攝取途徑,其對Fe3+有很強的親和力,是在鐵缺乏條件下合成和分泌的。PA能合成兩種內源性鐵載體:熒光嗜鐵素(PVD)和鰲鐵蛋白(PCH)。PVD是一種肽類鐵載體,含有兩個異羥肟基團和一個熒光二羥基喹啉發色團;而PCH是以水楊酸為基礎的鐵載體,相比PVD而言,PCH對鐵的親和力較低。PA優先合成PCH,但在環境鐵濃度非常低時,PVD的合成明顯增多[4]。二者在與各自特定的TonB依賴性轉運蛋白(TBDT)結合(FptA和FpvA)后,借助質膜上TonB-ExbB-ExbD復合物提供的能量將Fe3+鐵載體轉運到細胞周質;Fe3+在周質中完成解離并還原成Fe2+,Fe2+經周質三磷酸腺苷(ATP)依賴的通透酶(ABC轉運蛋白)跨質膜進入細胞質[5]。

在鐵充足的培養基中,PVD突變體(PvdA-)菌株僅在介質表面形成平坦均勻的菌層,而PCH突變體(PchA-)則形成類似野生型的復雜生物膜[6],表明PVD對生物膜生成影響更大。事實上,PVD發揮雙重作用,既是鐵載體,也是毒力因子(胞外蛋白酶PrpL和外毒素A)的激活信號。PVD對鐵的高親和力允許其能從宿主的轉鐵蛋白中螯合鐵,是引起小鼠燒傷模型和肺病模型的感染所必需的[7]。PCH-Fe3+復合物不僅通過鐵攝取促進PA毒力表達,而且還通過氧化還原反應引起宿主的氧化損傷和炎癥反應。囊性肺纖維化(CF)患者痰標本中,PCH合成量顯著增加,并引起持續的炎癥反應和導致組織損傷[8]。因此PVD和PCH二者都是顯著影響PA致病性的關鍵毒力因子。

PA可以利用多種異源性鐵載體,如腸桿菌素(大腸桿菌產生)、鐵絡素(構巢曲霉和黃青霉產生)和外螯合素(新金分枝桿菌產生)。鐵絡素可以影響PA生物膜的發育和彈性蛋白酶的活性,外螯合素介導的鐵攝取系統對生物膜的形成至關重要[5]。PA利用異源性鐵載體能力有助于增強其在多種微生物混合感染中的競爭力,機制可能是通過對鐵的競爭來抑制其他微生物的生長。

1.2血紅素攝取系統 血紅素無法以游離形式存在,因此鐵元素必須從血紅蛋白或血液結合素中攝取,PA可通過Phu系統、Has系統和Hxu系統獲得鐵。在Phu和Hxu系統中,分別通過PhuR和HxuR直接結合血紅素將其轉運到細胞周質;而在Has系統中,首先胞外血紅素結合蛋白(HasAp)結合血紅素,形成“HasAp-血紅素”復合物輸送至HasR,而后再將血紅素轉運到細胞周質[9]。

周質中,血紅素結合蛋白PhuT結合血紅素并將其輸送到PhuUV ABC轉運蛋白,然后穿過質膜進入細胞質。血紅素進入細胞質內,血紅素被血紅素分子伴侶Phus結合,運輸給血紅素加氧酶(Hemo),進一步裂解生成膽綠素Ⅸβ(BVⅨβ)和Ⅸδ(BVⅨδ)、CO和Fe3+[10]。PA產生另一種血紅素加氧酶BphO切割血紅素產生BVⅨα。BVⅨα是PA色素BphP的發色團,能感知紅光和遠紅光,這種感光調節能力與生物膜的形成和毒力高度相關[10]。

在Hxu系統被鑒定出之前,盡管在PA感染期間,HasAp和PhuR表達上調,但是血紅素系統在影響PA毒力的重要性長期被低估。最新研究發現血流感染中分離出的PA,Hxu系統呈高表達,并且Hxu系統缺失能降低了PA的致病力。另外Hxu系統過表達會增加PA敗血癥的風險[11]。

1.3Feo系統和BqsR/BqsS雙組分攝取系統 在囊性纖維化(CF)患者的肺部黏液層或生物膜的底部極易形成厭氧和(或)較低pH值的微需氧環境,Fe3+還原為水溶性的Fe2+,Fe2+成為鐵的主要來源。細胞胞外Fe2+通過未定義的孔蛋白通道自由擴散到周質,通過周質中β-1,2葡聚糖螯合Fe2+,選擇性實現富鐵條件下限制游離鐵誘導的細胞毒性和限鐵條件下促進菌株生長[6]。

周質中Fe2+大部分通過Feo ABC系統轉運至胞內,該系統由FeoB滲透酶、FeoA和FeoC蛋白組成;同時PA在生物膜中形成另一個Fe2+轉運系統,即BqsR/BqsS雙組分系統[10]。二者都受到吩嗪的調節,吩嗪是PA產生的二級代謝產物。吩嗪-1-羧酸(PCA)是綠膿菌素(PYO)的前體,PCA和PYO均具有氧化還原能力,能將Fe3+還原為Fe2+。BqsR/BqsS系統可通過調節假單胞菌喹諾酮信號(PQS)(pqsA和phnA)和鼠李糖脂(rhlA)的生物合成而調節生物膜形成。當病情加重時,CF患者肺部檢測到吩嗪和Fe2+的大量積累,給予Fe2+和Fe3+兩種離子的螯合劑聯用可以很大程度上降低PA生物膜形成能力[12]。

1.4PQS系統介導的鐵攝取 群體感應系統(QS)是細菌細胞間信號交換的過程,依賴于對稱為自動誘導劑的細胞外信號分子的產生、檢測和反應,并允許細菌群同步改變行為,以響應鄰近群落的種群密度和物種組成的變化。QS對于PA多重毒力表達和生物膜形成至關重要。

PA有PQS、LasIR和RhlIR 3種主要QS系統。PQS系統產生特異性的2-烷基-4-喹諾酮信號(AQs),包括信號分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)及其前體2-庚基-4-喹諾酮(HHQ)。PQS中3′-OH基團能螯合生理pH下的Fe3+,降低環境中鐵的濃度,最終誘導PVD和PCH基因表達,借此增強鐵攝取。另外PA還能通過H3型Ⅵ分泌系統(H3-T6SS)效應分子TseF利用PQS與FptA的連接來實現螯合的Fe3+,但其利用效率低于其他鐵攝取途徑[13]。

1.5鐵穩態調節 過量攝取鐵會出現不良后果,鐵通過Fenton反應和Haber-Weiss反應與氧結合生成活性氧(ROS),導致大分子(如脂質和蛋白質)的破壞,引起細菌死亡。因此保持鐵穩態是至關重要的。

PA鐵穩態主要由鐵攝取調節因子(Fur)進行調節,而且Fur的調節作用是PA必不可少的。Fur不僅作為基因轉錄的直接抑制因子,直接激活Fur與靶基因的啟動子區域的結合;而且作為基因轉錄的間接抑制因子,通過間接激活小RNA的Fur依賴性表達(即PrrF1、PrrF2和PrrH)、置換絲氨酸蛋白樣蛋白或阻斷結合絲氨酸蛋白抑制劑[14]。Fur不僅調節鐵穩態基因的表達,還參與調節許多其他重要功能的基因,如毒力、呼吸、中樞代謝和應激反應等。

PrrF1和PrrF2的表達在富鐵條件下被Fur阻斷;而在限鐵條件下被激活,通過下調非必需含鐵蛋白質的表達來滿足鐵需求。PrrH被編碼在prrF位點內,鐵和血紅素都能通過血紅素運輸蛋白PhuS抑制PrrH的表達[15]。血紅素合成基因(hemB和nirL)和PVD基因pvdL是prrF 位點的靶標,通過調節prrF/prrH sRNA基因的轉錄,PhuS可以整合胞外血紅素的代謝進入鐵穩態調節網絡[16]。另外PA的毒力也依賴于PrrF和PrrH調控相關蛋白表達來實現,比如抗氧化應激蛋白質的基因表達,如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶;鐵螯合相關蛋白,如細菌鐵蛋白以及有氧或無氧呼吸相關蛋白,如烏頭酸酶、富馬酶和琥珀酸脫氫酶等[17]。

鐵載體能夠充當誘導自身合成的信號分子,但PVD的生物合成和吸收不是由Fur直接調控的,而是通過兩個ECF σ因子PvdS和FpvI間接調節PVD生物合成。這兩個ECFσ因子被跨內膜抗σ因子(FpvR)的細胞質結構域隔離,當在Fe3+PVD復合物與外膜FpvA-TBDT復合物結合后,觸發FpvR蛋白水解,從而釋放PvdS和FpvI,使其能夠與核心RNA聚合酶結合來促進鐵代謝相關基因的轉錄[18]。

總之,PA通過動態調節限鐵條件下的鐵攝取和富鐵條件下的鐵外排,一方面應對宿主感染期間的營養免疫帶來的鐵缺乏,另一方面消除胞內鐵富足導致的細胞毒性,保證自身鐵穩態來實現生存需求。

2 鐵元素參與生物膜形成調控

外源添加鐵螯合劑乳鐵蛋白明顯抑制PA生物膜的形成,而適宜的高鐵濃度環境反而可促進PA生物膜的形成,說明鐵可作為一種信號調節PA生物膜的發育[6]。PA生物膜生成受多個系統調控,包括QS系統、Gac/Rsm和c-di-GMP雙組分調控系統。

PA 3個主要QS系統(即PQS、LasI和RhlI系統),通過這3個QS系統的相互作用來調控多種毒力基因表達和生物膜發育。LasI和RhlI系統分別產生N-3-氧代十二烷?；?L-高絲氨酸內酯(3-oxo-C12-HSL)和N-丁?；?L-高絲氨酸內酯(C4-HSL),并與相應的受體蛋白(轉錄因子LasR 和RhlR)結合后激活一系列基因(包括lasI和rhlI基因)的轉錄;PQS系統產生信號分子PQS及其前體HHQ。

3-oxo-C12-HSL的降解產物3-(1-羥基茚基)-5-(2-羥乙基)吡咯烷-2,4-二酮(C12-TA)對Fe3+具有很高的親和力,C12-TA能夠溶解金黃色葡萄球菌并進入其胞內鐵存儲池來獲取鐵[19]。PQS系統螯合Fe3+,誘導鐵饑餓和鐵載體介導的鐵攝取。PA外膜囊泡(OMV)通常存儲有含鐵的PQS分子,可作為鐵饑餓條件鐵的替代來源[13]。LIU等[20]發現PCH合成基因簇(包括pchDCBA操縱子、PCH合成酶基因phcF和Fe3+-PCH外膜受體fptA)和PVD合成酶基因(pvdJ、pvdA和pvdD)在響應PQS時上調。RhLI系統調控表面活性劑鼠李糖脂的表達,在生物膜形成的早期,限制鐵能誘導鼠李糖脂的產生,使細胞發生抽搐運動,形成扁平的無結構生物膜[21]。鐵可以通過干擾PrrF1和PrrF2的表達,與PQS建立聯系,促進HHQ和PQS的產生[22]。

Gac/Rsm和c-di-GMP通過調節EPS,與細菌在浮游生物和生物膜之間的生活方式轉換有關。細胞胞外多糖作為EPS的基本成分,構成了PA的生物膜結構,藻酸鹽、Pel和Psl是PA產生的主要胞外多糖。環境低鐵可以加速藻酸鹽的表達,而增加鐵能通過抑制ArmZ來刺激Psl的合成,ArmZ是一種轉錄調節因子,能夠滅活Psl基因操縱子并激活藻酸鹽的產生。鐵還可以通過抑制鼠李糖脂的合成來促進Psl的生成[23]。此外,還發現胞外多糖能夠結合鐵。Psl既能結合Fe2+,又能結合Fe3+,Pel常與Fe2+結合,而藻酸鹽僅與Fe3+結合。CF患者痰液樣本中Fe2+濃度與肺纖維化嚴重程度呈正相關,高濃度鐵能誘導刺激Psl的合成及Psl介導的生物膜形成[24]。Gac和c-di-GMP通過促進PVD的表達,協同作用增強鐵攝取。Gac和c-di-GMP需要Pel和Psl來介導PVD的產生。細胞外DNA(eDNA)也是生物膜基質的組成部分,由裂解細胞釋放,促進細胞間最初的黏附和表面聚集。YANG等[25]發現低鐵通過提高eDNA的表達促進銅綠假單胞菌生物膜的發育,而高鐵水平則抑制eDNA的表達。

PA生物膜發育成熟與QS系統精細調節密切相關,鐵元素在其中發揮重要作用,因此對鐵攝取的干預也成為阻斷PA生物膜形成的潛在靶點。

3 鐵元素抗生物膜感染的策略

生物膜形成是臨床抗PA感染失敗的主要原因之一,因此破壞或阻斷參與生物膜發育成熟可作為抗生物膜感染的有效策略。鑒于鐵在生物膜發育成熟中的作用,因此通過靶向干預鐵攝取和/或通過鐵螯合劑調節鐵攝取來影響生物膜的發育成熟是抗感染的新策略。

3.1鐵拮抗劑 金屬鎵(Ga3+)與Fe3+有相同的原子大小和氧化態,但不能進行氧化還原反應。Ga3+通過模擬鐵元素和抑制多種酶的催化活性,阻斷依賴于鐵的氧化還原循環過程來發揮抗菌活性。Ga3+能抑制PA生物膜的生長,并能分散已形成的生物膜。給予局部給藥,Ga3+明顯促進PA感染傷口愈合[26]。鎵可以在胞外與PVD結合,減少胞外Fe3+-PVD合成和依賴PVD的鐵攝取來抑制PA生長[7]。

基于鎵的組合策略比單獨使用鎵更能增強抗感染的作用。鎵-原卟啉Ⅸ (Ga-PPⅨ)化合物,通過PhuR進入細胞內,靶向結合血紅素依賴性b型細胞色素并抑制細胞呼吸實現抗生物膜作用[27]。鎵-去鐵胺比鎵鹽更好地抑制PA浮游生長,并通過減少細胞內鐵的量來阻止生物膜的形成[28]。目前一些含鎵生物材料,包括介入生物活性玻璃支架、含鎵磷硅酸鹽玻璃和鎵接枝鈦植入物,正被應用于醫學假體設備和涂層導管中,以減少生物膜形成。

需要注意的是GA是一種腎毒性藥物,使用過程中應當緩慢靜脈輸注,同時要求患者在輸注期間補充水份,一方面不會影響腎功能、電解質水平和血細胞計數,另一方面能改善CF患者的肺功能[29]。

3.2鐵螯合劑 鐵螯合劑能螯合生長環境中的鐵達到限制病原體的可用鐵源而實現抗菌目的。乳鐵蛋白是中性粒細胞和外分泌腺產生的內源性螯合劑,是一種急性期蛋白質,在感染引起炎癥期間就會產生并增加,該分子的抗菌特性也存在于乳鐵蛋白衍生肽和合成類似物肽中。乳鐵蛋白螯合Fe3+,刺激PA抽搐運動,使細菌在表面上移動而不是附著和形成生物膜[17]。Alaxia SAS開發的乳鐵蛋白和硫氰酸鹽組成的螯合劑ALX-009,用于治療CF患者的PA感染[30]。轉鐵蛋白是由人體肝臟合成內源性螯合劑,使用去鐵的轉鐵蛋白可來螯合游離鐵,發揮抗菌活性[31]。

FDA已批準的鐵螯合劑,去鐵胺、地拉羅司和去鐵酮臨床應用表現出比其他治療方案更高的安全性。去鐵胺可作為治療CF肺炎的替代方案之一[32]。盡管2,20-聯吡啶、二乙烯三胺五乙酸和EDTA被證實具有抑制PA生長和生物膜形成的能力,但是使用鐵螯合劑作為抗菌藥物的佐劑比單獨使用具有更明顯的抗生物膜作用。鐵螯合劑N,N′-雙(2-羥芐基)乙二胺-N,N′-二乙酸(HBED)已被證明是黏菌素的有效佐劑。二者聯用成功地抑制了需氧和厭氧條件下的PA生物膜形成[33]。妥布霉素和去鐵胺或地拉羅司的聯合治療使生物膜形成減少了90%,且增強妥布霉素的抗菌作用[34]。

臨床應用中要注意細胞毒性是鐵螯合劑治療的缺點,專家建議通過吸入給藥途徑,這不僅減少了鐵螯合劑的潛在全身不良反應,而且還增加了藥物對肺部的局部作用[32,35]。

3.3“特洛伊木馬”策略 生物膜耐藥性的原因在于細菌胞外膜和生物膜通透性降低。大多數抗PA感染的抗菌藥物必須穿透細胞膜才能到達胞內靶點發揮作用?！疤芈逡聊抉R”策略基于抗菌藥物與鐵載體的偶聯,通過外膜上特異性鐵載體的TBDT,促使與鐵載體偶聯藥物透過低滲透性PA外膜從而進入胞內,實現藥物跨膜轉運。

頭孢地爾-鐵載體偶聯物基于此原理,該偶聯物一方面增強了對β內酰胺酶的穩定性,同時利用其鐵載體樣特性進入周質空間的能力大大提高,因此頭孢地爾-鐵載體被認為比頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南對所有耐藥的PA更有效[36]。環丙沙星-鐵載體偶聯物,能明顯提高膜內環丙沙星的藥物濃度,對環丙沙星耐藥菌株AM85也有抗菌活性[37]。

3.4QS抑制劑 鑒于QS在生物膜發育中的重要作用,具有抗QS活性的藥物,也稱為QS抑制劑(QSIs),這些抑制劑具有特定的小范圍靶標,不會對有益菌造成傷害,同時降低了細菌耐藥性的風險。近年來,使用QSIS來治療PA感染已被廣泛研究。姜黃素、兒茶素、咖啡因、水楊酸、丁香酚、姜黃素、迷迭香酸、柚皮苷、綠原酸、桑色素、植物醇和2,5-哌嗪二酮等QSIS可通過抑制QS信號分子及其前體的合成,或作為信號分子的拮抗劑或抗體,以非殺菌或非抑菌的方式減弱PA毒力和抑制生物膜形成[38-39]。蛋白質組學分析表明,給予姜黃素后,PVD上調和亞鐵氧化酶的下調伴隨胞內Fe3+含量升高,隨之Fe3+通過Fenton反應轉化為Fe2+,最終導致大分子的損傷[40]。

3.5納米粒子 具有體積小、可修飾、比表面積大、對疏水性和親水性藥物分子適應性強、在生理體液中的穩定性高、對靶點的特異性等特點,被認為是理想的抗菌材料。納米銀顆粒(AgNPs)破壞Fe-S簇,通過Fenton反應產生Fe2+,引起羥基自由基的產生,破壞DNAs、蛋白質和脂質,從而導致細菌死亡。AGNPs還可以通過破壞細菌細胞壁或細胞膜的完整性、破壞二硫鍵和干擾細胞信號通路來破壞生物膜。AGNPs與妥布霉素或氨曲南聯合用藥能顯著降低生物膜內細菌濃度和細菌生物活性[41]。

小鼠肺炎模型,納米顆粒微泡(Mbs)內含封裝哌拉西林和Fe3O4納米粒子的核芯。在超聲波刺激下,Mbs能物理地破壞生物膜的結構,并增強Fe3O4納米顆粒和哌拉西林對生物膜的滲透。一方面在哌拉西林的幫助下,Fe3O4納米粒子能降解生物膜基質并殺死細菌;再者Fe3O4微?？赏ㄟ^將巨噬細胞極化為促炎表型來激活生物膜消除的免疫逃逸,有效地治療小鼠模型的慢性肺部感染[42]。

此外通過研發鐵代謝途徑的疫苗,制備單克隆抗體來與鐵攝取競爭;利用晶體學方法確定細菌鐵代謝途徑中酶的結構成分,合成針對鐵代謝過程酶的人工抑制劑。盡管這些都尚未形成針對PA的許可疫苗和藥物,但這都是值得高度重視的抗PA生物膜感染的新靶點。

總之,生物膜形成賦予PA對外界環境更強的適應能力并增強抗菌藥物耐藥性,是PA感染性疾病難以治療的重要原因。鐵元素是PA生物膜生長所必需的。PA的鐵攝取能力被認為是其毒力和生物膜形成的重要標志,因此以干預和阻斷鐵代謝為目標的藥物正在成為抗菌研究領域的新熱點。令人鼓舞的是,一系列鐵拮抗劑和螯合劑已經開發出來,有的已經進入臨床試驗?？梢灶A見,隨著對鐵元素在PA生物膜形成中作用認識的不斷深入,在不久的將來,靶向鐵穩態藥物將在臨床上應用于PA及其生物膜感染相關疾病的治療。