二代測序技術在腫瘤治療中的應用進展*

唐 薇 綜述,侯玉磊,陳 輝 審校

重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科,重慶 400016

根據世界衛生組織(WHO)最新發布的全球癌癥統計報告,惡性腫瘤仍是人類70歲之前最常見的死因[1]。目前腫瘤的傳統治療手段包括手術切除、放射治療、化學治療等。手術切除對于腫瘤晚期特別是伴遠處轉移的患者并不適用,傳統的放射治療和化學治療雖適用于大多數腫瘤,但其不良反應會給患者帶來傷害[2-3]。此外,由于腫瘤的異質性,并非所有腫瘤細胞對常規的放化療都具有相同的敏感性,未被有效清除的癌細胞是癌癥復發的關鍵驅動因素。腫瘤異質性是指同一種惡性腫瘤在不同患者個體間或者同一患者體內不同部位的腫瘤組織中存在不同類型的亞克隆細胞,它們在分化程度、侵襲轉移能力以及對藥物的反應性等方面均有差異[4]。腫瘤的異質性給腫瘤的治療帶來巨大困擾,為了能針對性制訂臨床治療方案,有效提升臨床治療效果,需要對腫瘤異質性的生物學特性進行深入了解。

基因組學和表觀遺傳學改變與腫瘤異質性的發生密切相關,近年來,基因測序技術的迅速發展,使臨床醫生對腫瘤在分子生物學層面上的認識得到突破性提高[5-8]。二代測序技術(NGS)的出現,解決了原有基因測序技術通量低、成本高等問題,加快了研究者們探索腫瘤異質性的腳步,為腫瘤患者制訂個體化治療方案、篩選靶向藥物等奠定了堅實的基礎。本文將對NGS及其在常見惡性腫瘤治療中的應用進展進行綜述。

1 NGS

隨著分子生物學技術的發展,人們對疾病的研究逐漸聚焦于全基因組方向。測序技術的出現,為人們深入探索基因的結構和功能提供了有力手段。傳統的分子診斷方法,如免疫組織化學檢測(IHC)、聚合酶鏈反應(PCR)和熒光原位雜交檢測(FISH)等,由于檢測應用范圍窄、通量低、數據產出低、時間成本高、樣本需求量大等自身局限性,影響臨床診療的使用效率[9-10]。

NGS又稱高通量測序、大規模平行測序,是基于PCR和基因芯片發展而來的DNA測序技術。相較于采用合成終止測序的一代測序技術,NGS引入了可逆終止末端,實現了邊合成邊測序,可以同時讀取數以千計DNA片段,極大地提升了檢測效率。NGS的基本原理是在DNA片段擴增時,從中捕捉新添加的堿基所攜帶的熒光信號,進而確定DNA的序列[9]。NGS解決了一代測序技術存在的耗時長、通量低等問題,使基因檢測的效率得到大幅提升,被廣泛運用于生命科學的研究中[9]。

近年來有研究顯示,NGS在惡性腫瘤的研究與臨床應用中,通過對腫瘤相關基因進行篩查,可以發現罕見的基因突變以及融合基因等異常,從中挖掘治療靶點,選擇靶向藥物,并追蹤患者在治療過程中腫瘤的演變特征,甚至能夠對患者的預后及復發率進行評估[7-8,11-12]。本文將圍繞NGS在常見惡性腫瘤治療中的應用及進展進行綜述。

2 NGS在惡性腫瘤治療中的應用進展

2.1乳腺癌 乳腺癌是女性患者最常見的一種惡性腫瘤,是45歲以下女性惡性腫瘤死亡的首要原因[1]。乳腺癌具有高度腫瘤異質性,發病機制尚不明確。研究者們運用對乳腺癌基因組和分子生物學方面的知識,發現了篩查乳腺癌的生物標志物,研發出基于基因突變位點的靶向治療藥物[13]。因此,應用NGS對乳腺癌患者進行基因測序,可以協助臨床醫生進行乳腺癌的早期篩查、針對性制訂和調整治療方案。

NGS的出現為大規模篩查乳腺癌關鍵驅動基因提供了更便捷的手段。基于NGS的全面基因組測序(CGP)技術可涵蓋具有臨床價值的基因,在基因變異檢測上具有較高的敏感性,能夠非常準確地呈現測序結果[14]。ROSS等[14]利用CGP技術對8 654例乳腺癌患者的基因數據進行分析,結果顯示,80.4%患者至少有1條信號通路發生基因突變,超過一半的患者可能由于基因突變而對特定的信號通路抑制劑敏感。利用CGP技術可以發現特定靶基因的改變,臨床可通過這些改變預測患者對特定治療方法的敏感性;通過NGS篩查關鍵信號通路是否突變,從而有針對性地制訂個體化治療方案。

有研究表明,循環腫瘤DNA(ctDNA)可對乳腺癌患者在新輔助化療(NAC)中的反應和預后進行預測[15-17]。但早期患者血液中的ctDNA水平通常較低,常規檢測方法會受到一定限制,NGS具有高敏感、樣本消耗少等優點,運用NGS檢測ctDNA,在提示早期乳腺癌患者根治性術后存在微小殘留病灶(MRD),以及預測疾病復發等方面均顯示出較好的臨床應用價值[18]。MAGBANUA等[17]從84例高危早期乳腺癌患者在不同治療時期采集的血液中提取出游離DNA,通過NGS檢測治療前后患者的血液中ctDNA的變化。結果表明,ctDNA清除不足是治療效果不佳和腫瘤轉移與復發的顯著預測因素。由此可見,ctDNA測序結果是乳腺癌NAC療效和轉移性復發的重要預測因子,在患者NAC期間對其ctDNA水平變化進行監測,有助于實時評估治療反應,及時改善治療方案。

綜上所述,NGS在乳腺癌的篩查、個體化治療等方面發揮了巨大作用。

2.2肺癌 肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因,也是男性患者中最常見的惡性腫瘤[1]。根據病理組織學可將肺癌大致分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大類[19],其中NSCLC約占80%～85%。作為一種異質性疾病,肺癌的病變過程與基因組的改變緊密相關。其中,表皮生長因子受體(EGFR)對細胞增殖和凋亡信號通路的改變是NSCLC發生的重要原因。有研究表明,EGFR突變是NSCLC已知的治療靶點,19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變是最常見的突變類型,約占EGFR突變類型的85%以上[20],因此,臨床可以通過檢測EGFR的突變預測NSCLC患者對靶向藥物的反應性。對EGFR突變的檢測,早前常依賴于一代測序,雖然它能夠檢測特定基因組區域內的所有突變,但當樣本中腫瘤細胞富集不足時,存在較大假陰性風險[21]。突變特異性PCR試劑盒雖能檢測腫瘤細胞含量低至1%～5%的樣本[22],但目前可用的PCR試劑盒不能充分覆蓋EGFR突變類型[23-24],可能會遺漏潛在的可用于指導選擇靶向藥物的EGFR位點改變。

隨著NGS的出現,EGFR罕見突變的檢出率也逐步提高。作為一種高靈敏的技術,NGS可對罕見基因突變進行分子評估,還能從不同患者的樣本中檢測到多個熱點基因,具有更高的診斷準確性,且節省了樣本周轉時間[24]。目前,常用的NGS檢測組合已能同時分析包括EGFR在內的大量與臨床相關的熱點基因[25]。

EML4-ALK融合基因是NSCLC靶向治療的重要靶點[26]。ALK抑制劑可以抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡。最初對ALK基因重排檢測依賴于FISH技術,但該方法較為復雜,對標本質量和設備要求高,目前正逐步選用其他方法補充或替代FISH技術。基于NGS所設計的專門用于檢測融合基因的方法,還可以進行更為復雜的基因重排分析,在實際應用中展現出良好的性能[27]。

此外,KRAS、BRAF、NTRK等是NSCLC中變異率相對較低的驅動基因。針對這些基因變異的靶向藥物仍處于前瞻性臨床研究階段。傳統的檢測方法不能完全覆蓋上述基因的突變類型,而基于NGS的檢測可以滿足相關需求。

隨著NGS在肺癌診療中的應用,會極大促進了肺癌分子生物學研究,同時為患者在診斷、用藥指導等方面提供強有力的支持。

2.3結直腸癌(CRC) CRC是世界第三大常見的惡性腫瘤[1]。CRC的主要治療方式為手術切除,但對于中晚期患者來說,往往需要加入常規化療或靶向藥物治療。NGS技術為CRC的靶向藥物選擇提供了實驗室支撐。利用NGS檢測CRC患者中KRAS/NRAS/BRAF的突變,得到了美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)發布的《結直腸癌臨床實踐指南》的推薦:所有轉移性CRC患者均應進行RAS和BRAF突變的基因分型,可以單獨檢測,也可以作為NGS檢測組合的一部分進行檢測[28]。

靶向治療和常規化學治療產生藥物耐受的重要機制之一是腫瘤內異質性(ITH)。研究者們對NGS測得的核苷酸序列進行深入分析,結合突變-等位基因腫瘤異質性(MATH)評分來衡量ITH的程度,為CRC治療方案提供指導[29]。GREENBAUM等[30]通過NGS對超過400個癌癥相關基因進行檢測,分析直腸癌患者MATH得分與NAC治療效果之間的關系。結果表明,MATH得分與NAC療效成反比,分數越高則療效越差。因此,利用NGS結合MATH評分來對ITH程度進行評估,有利于為患者選擇恰當的治療方案。

微衛星高度不穩定性(MSI-H)常用來判斷CRC的化療效果以及預后評估。但反映MSI狀態的DNA序列在腫瘤組織中含量很低,NGS在MSI的檢測方面具有明顯的優勢,該技術可一次性捕獲多段基因組序列,在對腫瘤進行基因分型、檢測驅動基因變異的同時,完成對MSI的狀態評估,極大地提高了低含量樣本的分子診斷效率。此外,基于ctDNA的MSI-NGS也逐步應用到臨床,為病理組織取樣困難的患者提供更多選擇[31]。隨著NGS在CRC臨床應用中的拓展,將有助于CRC的早期診斷、治療、判斷療效及預后評估。

2.4白血病 白血病是一組具有異質性的血液系統惡性腫瘤,以造血干細胞惡性增殖,引起白血病細胞浸潤組織器官為特征,繼而影響人體正常造血功能。化學治療和造血干細胞移植是白血病常用的治療手段,近年來,NGS逐步在白血病分子靶向治療藥物的研發和選擇中起到指導作用[32-34]。

急性髓系白血病(AML)是正常髓系造血干細胞基因突變所致,在成人急性白血病中多見。由于測序技術的進步,研究者們得以更深入地了解AML的基因突變情況,NGS的出現為AML的分型、治療方案選擇、預后評估等方面提供了重要幫助[35]。白血病細胞存在成百上千種基因突變類型,但只有少數關鍵基因突變會導致AML發生。通過NGS篩選出的AML相關突變基因包括NPM1、RUNX1、FLT3、TP53、IDH1/2、ASXL1等,已被歐洲白血病網納入為AML的治療靶點[36]。選擇基于這些靶點研發的分子靶向藥物進行治療能提高AML患者的療效。例如二代FLT3激酶抑制劑喹扎替尼,臨床試驗表明,它對難治性AML療效確切,完全緩解率可達44%,目前該藥聯合標準化療方案仍處于試驗階段,有望成為合并FLT3突變的AML患者的較好選擇[37];針對IDH1/2突變的靶向藥物恩西地平和艾伏尼布在治療IDH1/2突變的初發AML的研究中也已取得顯著成果[37]。同樣,包括FLT3抑制劑、IDH抑制劑、RUNX1抑制劑等在內的AML治療藥物的選擇,都可通過NGS來提供實驗室支撐。

NGS在急性淋巴系白血病(ALL)的靶向藥物選擇方面也提供了較大幫助。融合基因的產生是ALL最常見的基因突變類型[38]。針對BCR-ABL融合基因的TKIs(伊馬替尼、泊那替尼)和JAK抑制劑(盧克替尼)等已被證實對存在BCR-ABL突變或Ph+的ALL患者具有療效[32]。NGS在大型基因檢測中的應用能較全面地識別ALL患者的基因突變情況,為尋找潛在治療靶點帶來更多可能,也為ALL治療方案的選擇指明方向。

MRD指腫瘤患者經過治療后體內仍殘留少量腫瘤細胞,是對患者療效和預后進行評估的重要指標,快速、準確地檢測MRD是白血病治療過程中的關鍵環節[39]。常規檢測MRD多利用實時定量聚合酶鏈反應技術(RT-qPCR)[40],但有研究表明,NGS在該項檢測中靈敏度更高[34]。KOTROVA等[41]對76例患者分別通過NGS和RT-qPCR檢測得到的MRD結果進行比較,發現NGS能夠更精確地預測疾病復發率,還能夠提供關于B淋巴細胞重排等信息。雖然NGS還尚未常規用于MRD的檢測,但此技術的臨床應用價值已獲得國內外專家的認可[42]。

可以預見,隨著NGS應用的拓展,白血病的治療前景也將愈加廣闊。

2.5其他腫瘤 此外,NGS技術在多種惡性腫瘤的治療中都發揮著作用。85%的鼻咽癌患者均存在EGFR高表達[43],NGS在鼻咽癌發病機制的研究和靶向治療藥物的選擇上能提供有力支持。前列腺癌是男性第二高發癌癥[1],利用NGS對前列腺癌患者進行深度測序,可以更加清晰地闡明影響前列腺腫瘤發生的機制,加深人們對前列腺癌生物學特性理解[44],為治療方案的選擇提供參考。甲狀腺癌是一種常見的內分泌腫瘤,BRAF突變使甲狀腺結節惡性風險高達99.8%,針對甲狀腺癌的分子檢測已從單基因BRAF檢測發展到多基因多位點變異分析,NGS可以更全面、高效地檢測到基因突變類型,為甲狀腺癌相關基因譜的完善做出貢獻[45]。

無論是探索疾病的發病機制還是尋找更精確的治療靶點,都離不開對突變基因進行深入分析,NGS作為一種高效、靈敏且全面的檢測方法,在其中的作用越來越明晰。

3 總結與展望

隨著NGS在科學研究和臨床診療中的應用愈發廣泛,人們可以更高效地獲取腫瘤細胞基因的結構、表達水平等遺傳信息,有利于腫瘤發病機制的研究;還能更全面地檢測目標基因的變異,為靶向藥物的研發和選擇提供巨大的支持。但是,NGS對檢測設備要求較高,中小型醫院一般不具備開展NGS檢測的條件,此外,該技術的應用必將產生大量的生物信息數據,對患者的個人隱私也會造成一定威脅。不過筆者仍然相信,隨著科技與經濟的快速發展、政策的不斷完善,NGS在惡性腫瘤治療中的創造的價值會更加璀璨。