miR-203 靶向調(diào)節(jié)PEG3/NF-κB 信號通路對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響①

趙力敏 李雅婧 張勇剛 張穎瑋（深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，深圳 518110）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者死亡的主要原因［1］。目前研究認(rèn)為，炎癥-纖維化是DN 腎臟損傷的重要發(fā)展過程［2］。但引起DN患者腎臟炎癥-纖維化發(fā)展的靶向調(diào)控機(jī)制還不十分明確。

父本表達(dá)基因3（paternally expressed gene 3，PEG3）位于人類染色體19q13.43，為人類印跡基因之一，既往研究認(rèn)為PEG3 可作為腫瘤抑制啟動(dòng)子而介導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)展［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，PEG3 還可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）通路來調(diào)控細(xì)胞的炎癥、凋亡及纖維化過程［4］。已有研究證實(shí)，下調(diào)DN 模型大鼠中PEG3/NF-κB 表達(dá)，可顯著阻斷DN 大鼠腎臟的炎癥-纖維化發(fā)展過程，從而改善腎損傷，提示PEG3/NF-κB 通路活化可能與DN 腎臟纖維化損傷關(guān)系密切［5］。但PEG3/NF-κB 信號通路的基因靶向調(diào)控機(jī)制不明確。

本研究應(yīng)用基因信息預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-203 與PEG3 有靶向結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-203 異常表達(dá)也是引起DN患者腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)因素之一［6］。已有研究證實(shí)miR-203 低表達(dá)可誘發(fā)DN 大鼠腎臟NF-κB 炎癥通路活化而參與腎纖維化病變［7］，預(yù)示干預(yù)miR-203表達(dá)，很可能通過影響PEG3/NF-κB通路活化，治療DN 腎臟炎癥-纖維化病變。本研究建立大鼠體內(nèi)外DN 模型，對此進(jìn)行探究驗(yàn)證，以期為DN新藥研發(fā)及基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～200 g，3 月齡，購自北京科興中維生物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK（京）2020-0054。本實(shí)驗(yàn)符合3R原則，經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（GDY2102633）。腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）（貨號：BH0361，ATCC公司）；鏈脲霉素購自北京索萊寶公司；miR-203 模擬物（miR-203 mimic）及陰性對照（mimic NC）、PEG3 高表達(dá)重組載體（pcDNA-PEG3）及陰性對照（pcDNA-NC）均由上海生工生物有限公司構(gòu)建；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PEG3、NF-κB、p-NF-κB、IL-6、IL-1β、Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、α-SMA、TGF-β1抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 DN動(dòng)物模型建立及分組 取SD大鼠50只，給予高脂飼料（含12%蛋白、38%脂肪、50%碳水化合物）喂養(yǎng)5 周后，參照文獻(xiàn)［8］方法于大鼠腹腔注射65 mg/kg 鏈脲霉素溶液3 d，1 次/d，建立大鼠DN模型，取大鼠腹主動(dòng)脈血測空腹血糖，選擇空腹血糖超過200 mg/dl 的大鼠（共50 只）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、miR-203 mimic 組、mimic NC 組、miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組、miR-203 mimic+pcDNA-NC 組，每組10 只。另取10 只大鼠正常飼養(yǎng)作為對照組。

miR-203 mimic 組及mimic NC 組大鼠分別于造模成功后，經(jīng)尾靜脈注射miR-203 模擬物（miR-203 mimic）及陰性對照（mimic NC）載體質(zhì)粒；miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組及miR-203 mimic+pcDNANC 組大鼠注射miR-203 mimic 載體的同時(shí)，分別經(jīng)尾靜脈注射PEG3 高表達(dá)重組蛋白載體（pcDNAPEG3）及陰性對照（pcDNA-NC），各質(zhì)粒注射濃度及體積分別為1 nmol/50 μl 及200 μl/kg，各組連續(xù)注射4周，2 次/周；模型組及對照組經(jīng)尾靜脈注射10 ml/kg生理鹽水。

給藥期間觀察大鼠飲食及活動(dòng)狀況。給藥結(jié)束后，收集24 h 尿液，試劑盒法測24 h 尿蛋白含量；大鼠禁食禁水12 h，取腹主動(dòng)脈血3 ml，ELISA 法測空腹血糖、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平，以評價(jià)腎功能水平。處死大鼠取腎，左腎切取一半組織，送電鏡室觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化、另一半組織用甲醛固定后制成石蠟切片，行Masson 染色觀察纖維化變化，右腎精密稱重后在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DN 細(xì)胞模型及分組 取NRK-52E 細(xì)胞株，37 ℃水浴復(fù)蘇后，取適量，用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基重懸后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，換為無胎牛血清的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后，分為對照組、模型組、miR-203 mimic 組、mimic NC 組、miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組、miR-203 mimic+pcDNA-NC組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

對照組用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h；高糖組參照文獻(xiàn)［9］方法用含2%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L葡萄糖）進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，以模擬DN 腎間質(zhì)纖維化模型；miR-203 mimic 組及mimic NC 組用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑向NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-203 mimic及mimic NC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染12 h 后用含2%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L葡萄糖）處理48 h；miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組及miR-203 mimic+pcDNA-NC 組在miR-203 mimic組基礎(chǔ)上分別轉(zhuǎn)染pcDNA-PEG3 及pcDNA-NC質(zhì)粒。

各組處理培養(yǎng)48 h 后，取細(xì)胞檢測培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6、IL-1β 水平及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平，以評價(jià)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥-纖維化變化。

1.2.3 qRT-PCR 檢測腎組織及細(xì)胞miR-203 表達(dá) 取冰凍腎組織及處理培養(yǎng)的各組細(xì)胞，粉碎、研磨及勻漿處理后，Trizol抽提總RNA，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得cDNA，行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。miR-203以U6 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-203 表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.4 ELISA 法檢測細(xì)胞中炎癥因子和促纖維化因子水平 取處理培養(yǎng)的各組細(xì)胞，勻漿處理后，取勻漿上清液，使用ELISA 試劑盒檢測細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TGF-β1、Collagen Ⅰ含量。

1.2.5 Western blot檢測腎組織及細(xì)胞PEG3、NF-κB及相關(guān)蛋白表達(dá) 取冰凍腎組織及處理培養(yǎng)的各組細(xì)胞，粉碎、研磨及勻漿處理后，取勻漿上清液，提取蛋白，BCA法測總濃度后，制備分離膠，取100 μg蛋白，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5%脫脂奶粉封閉及TBST洗膜后，滴加1∶500的一抗抗體（PEG3、NF-κB、p-NF-κB、IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、α-SMA、TGF-β1）及β-actin（1∶800）內(nèi)參抗體孵育過夜，1∶1 000 的HRP 羊抗兔二抗室溫孵育1 h 后，化學(xué)發(fā)光液浸膜顯色后，Image J軟件分析蛋白條帶相對灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-203 與PEG3的靶向關(guān)系 通過Starbase 網(wǎng)站預(yù)測miR-203 與PEG3 存在互補(bǔ)配對的堿基序列。構(gòu)建含有miR-203 結(jié)合位點(diǎn)的PEG3-3′UTR 野生型（WT）和突變型（MUT）片段，并分別克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中，得到PEG3-3′UTR-WT 及PEG3-3′UTR-MUT 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將PEG3-3′UTR-WT 及PEG3-3′UTR-MUT 質(zhì)粒分別與mimic NC 或miR-203 mimic 試劑共轉(zhuǎn)染至NRK-52E 細(xì)胞中，48 h后添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DN 細(xì)胞模型中miR-203 及PEG3/NF-κB 通路蛋白表達(dá)變化 與對照組相比，DN 細(xì)胞模型中miR-203 表達(dá)降低（P<0.05），PEG3、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 DN 模型細(xì)胞中miR-203、PEG3、p-NF-κB/NF-κB 表達(dá)變化比較（）Tab.1 Comparison of expression changes of miR-203，PEG3 and p-NF-κB/NF-κB in DN model cells（）

表1 DN 模型細(xì)胞中miR-203、PEG3、p-NF-κB/NF-κB 表達(dá)變化比較（）Tab.1 Comparison of expression changes of miR-203，PEG3 and p-NF-κB/NF-κB in DN model cells（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

圖1 Western blot 檢測DN 模型細(xì)胞中PEG3、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot detection of protein expressions of PEG3，p-NF-κB and NF-κB in DN model cells

2.2 DN模型大鼠腎組織中miR-203及PEG3/NF-κB通路蛋白表達(dá)變化 與對照組相比，DN 模型大鼠腎組織及細(xì)胞中miR-203 表達(dá)降低（P<0.05），PEG3、p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 DN 模型大鼠腎組織中miR-203、PEG3、p-NF-κB/NF-κB表達(dá)變化比較（）Tab.2 Comparison of expression changes of miR-203，PEG3 and p-NF-κB/NF-κB in kidney tissue of DN model rats（）

表2 DN 模型大鼠腎組織中miR-203、PEG3、p-NF-κB/NF-κB表達(dá)變化比較（）Tab.2 Comparison of expression changes of miR-203，PEG3 and p-NF-κB/NF-κB in kidney tissue of DN model rats（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

圖2 Western blot 檢測DN 模型大鼠腎組織中PEG3、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detection of protein expressions of PEG3，p-NF-κB and NF-κB in kidney tissue of DN model rats

2.3 miR-203 對PEG3 的靶向調(diào)控作用 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測試驗(yàn)及雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-203與PEG3之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，NRK-52E 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-203 mimic 和無突變的PEG3-WT 載體，可使NRK-52E 細(xì)胞中熒光素酶活性顯著下降（P<0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-203 mimic 和發(fā)生突變的PEG3-MUT 載體對熒光素酶活性無顯著影響（P>0.05）。見圖3、表3。

表3 熒光素酶活性比較（）Tab.3 Comparison of luciferase activity（）

表3 熒光素酶活性比較（）Tab.3 Comparison of luciferase activity（）

Note：Compared with PEG3-MUT+mimic-NC group，1）P<0.05.

圖3 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測圖Fig.3 Starbase database forecast

2.4 miR-203 對腎組織及細(xì)胞PEG3/NF-κB 通路靶向調(diào)控的影響 與對照組相比，DN 模型組腎組織及細(xì)胞中miR-203 表達(dá)降低（P<0.05），PEG3、p-NFκB/NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與DN 模型組相比，miR-203 mimic 組腎組織及細(xì)胞中miR-203 表達(dá)升高（P<0.05），PEG3、p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）；mimic NC 組miR-203及PEG3、p-NFκB/NF-κB 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與miR-203 mimic 組 相比，miR-203 mimic+pcDNAPEG3 腎組織及細(xì)胞中miR-203 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），PEG3、p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。miR-203 mimic+pcDNA-NC組miR-203及PEG3、p-NF-κB/NF-κB 蛋白表達(dá)與miR-203 mimic組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4、表4。

表4 DN腎組織及細(xì)胞中miR-203、PEG3、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)變化比較（）Tab.4 Comparison of protein expressions of miR-203，PEG3 and p-NF-κB/NF-κB in DN renal tissues and cells（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with miR-203 mimic group，3）P<0.05.

圖4 腎組織及細(xì)胞中PEG3、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of PEG3，p-NF-κB，NF-κB in renal tissues and cells

2.5 上調(diào)miR-203 對DN 大鼠腎組織結(jié)構(gòu)、纖維化病變及腎功能的影響 電鏡觀察可見，對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠腎小球基底膜分層不清晰、增厚、細(xì)顆粒狀物質(zhì)沉積明顯，腎小囊呈玻璃滴狀病變，腎血管中不規(guī)則形態(tài)的紅細(xì)胞形成較多。miR-203 mimic組大鼠腎小球基底膜增厚減輕，分層（外疏松層、致密層和內(nèi)疏松）較清晰，細(xì)顆粒狀物質(zhì)沉積減少，腎小囊未見明顯玻璃滴狀病變，腎血管中紅細(xì)胞形態(tài)逐漸規(guī)則。mimic NC 組腎組織結(jié)構(gòu)病變與模型組相近。miR-203 mimic+pcDNANC 組腎組織結(jié)構(gòu)病變與miR-203 mimic 組相近。miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 腎組織結(jié)構(gòu)病變較miR-203 mimic組嚴(yán)重，但較模型組減輕，見圖5。

圖5 大鼠腎組織電鏡、Masson染色圖（×400）Fig.5 Electron microscope and Masson staining of rat kidney chart（×400）

Masson 染色可見對照組腎組織膠原沉積染色較淺；模型組可見腎間質(zhì)膠原沉積染色加深，腎組織纖維化嚴(yán)重。miR-203 mimic 組大鼠腎間質(zhì)膠原沉積染色變淺，纖維化減輕。mimic NC 組腎組織纖維化與模型組相近。miR-203 mimic+pcDNA-NC 組腎組織纖維化與miR-203 mimic 組相近。miR-203 mimic+pcDNA-PEG3腎組織纖維化較miR-203 mimic組嚴(yán)重，但較模型組減輕，見圖5。

與對照組相比，模型組大鼠血糖、24 h 尿蛋白、血清SCr、BUN 水平升高（P<0.05）。與模型組相比，miR-203 mimic 組血糖、24 h 尿蛋白、血清SCr、BUN水平降低（P<0.05）；mimic NC 組血糖、24 h 尿蛋白、血清SCr、BUN 水平與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與miR-203 mimic 組相比，miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組大鼠血糖、24 h 尿蛋白、血清SCr、BUN 水平升高（P<0.05）。miR-203 mimic+pcDNA-NC組血糖、24 h 尿蛋白、血清SCr、BUN 水平較模型降低（P<0.05），見表5。

表5 大鼠24 h尿蛋白、血清Scr、BUN比較（）Tab.5 Comparison of 24 h urinary protein，serum Scr and BUN in rats（）

表5 大鼠24 h尿蛋白、血清Scr、BUN比較（）Tab.5 Comparison of 24 h urinary protein，serum Scr and BUN in rats（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with miR-203 mimic group，3）P<0.05.

2.6 上調(diào)miR-203 對DN 細(xì)胞炎癥-纖維化的影響 與對照組相比，模型組腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β 及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平升高（P<0.05）。與模型組相比，miR-203 mimic組腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平降低（P<0.05）；mimic NC 組腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β 及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與miR-203 mimic 組相比，miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β 及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平升高（P<0.05）。miR-203 mimic+pcDNA-NC 組腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β及促纖維化因子TGF-β1、Collagen Ⅰ水平較模型組降低（P<0.05），見表6。

表6 各組細(xì)胞IL-6、IL-1β、TGF-β1及CollagenⅠ水平比較（）Tab.6 Comparison of IL-6，IL-1β，TGF-β1 and Collagen Ⅰ of cells in each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with miR-203 mimic group，3）P<0.05.

2.7 上調(diào)miR-203 對DN 大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、α-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、TGF-β1 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與模型組相比，miR-203 mimic組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、TGF-β1 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）；mimic NC 組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、TGF-β1 蛋白表達(dá)與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與miR-203 mimic 組相比，miR-203 mimic+pcDNA-PEG3 組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、TGF-β1 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。miR-203 mimic+pcDNA-NC 組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ、TGF-β1 蛋白表達(dá)較模型組降低（P<0.05），見圖6、表7。

表7 各組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、CollagenⅠ和TGF-β1蛋白表達(dá)比較（）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-6，IL-1β，Collagen Ⅰand TGF-β1 in renal tissue of rats in each group（）

表7 各組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、CollagenⅠ和TGF-β1蛋白表達(dá)比較（）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-6，IL-1β，Collagen Ⅰand TGF-β1 in renal tissue of rats in each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with miR-203 mimic group，3）P<0.05.

圖6 各組大鼠腎組織IL-6、IL-1β、Collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expressions of IL-6，IL-1β，Collagen Ⅰand TGF-β1 in renal tissue of rats in each group

3 討論

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)表明，預(yù)計(jì)到2035年糖尿病患者將達(dá)到5.52 億，到2040 年，中國糖尿病患者將高達(dá)1.5 億，位居世界第一［10］。DN 一旦發(fā)現(xiàn)臨床癥狀時(shí)往往已發(fā)展成為腎衰竭，發(fā)達(dá)國家已將DN 認(rèn)為是引起終末期腎衰竭死亡的首位原因，我國DN 引起的終末期腎衰竭已高居第二位［11］。因此，防治DN的發(fā)生發(fā)展迫在眉睫。

持續(xù)的高脂高糖刺激，可引起動(dòng)物模型腎小球持續(xù)的濾過增加，導(dǎo)致腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的發(fā)展，并表現(xiàn)為蛋白尿及持續(xù)的腎功能下降［12］。本研究用高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)+鏈脲霉素誘導(dǎo)腎損傷建立大鼠DN 模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠出現(xiàn)血糖升高及蛋白尿升高、腎功能下降（血清SCr和BUN升高）、腎小球基底膜增厚及腎纖維化膠原沉積嚴(yán)重等類似人類DN 病理改變，提示造模成功。高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子如IL-6、IL-1β釋放，而IL-6、IL-1β 的釋放一方面會誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷，另一方面會促進(jìn)TGF-β1 活化來導(dǎo)致細(xì)胞由上皮特性轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型（即EMT 特性改變），EMT 特性改變過程中胞外基質(zhì)增厚及膠原沉積而引起纖維化［13-14］。大量體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖刺激可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥-纖維化病變，而模擬DN 腎纖維化發(fā)生機(jī)制［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，體外DN 模型細(xì)胞及DN 模型大鼠，腎小管上皮細(xì)胞及腎組織中IL-6及IL-1β、TGF-β1 及纖維化標(biāo)志因子如Collagen Ⅰ、CollagenⅣ、α-SMA 及FSP-1 表達(dá)均升高，進(jìn)一步證實(shí)，高糖環(huán)境下，炎癥與腎纖維化發(fā)展關(guān)系密切。

抑制炎癥反應(yīng)是緩解DN 腎纖維化發(fā)展的重要手段之一。HASSAN等［16］及XU等［17］發(fā)現(xiàn)阻斷NF-κB炎癥通路活化，可顯著抑制TGF-β1 促纖維化活化，而改善DN 體內(nèi)外模型腎纖維化病變。miRNA 與DN炎癥-纖維化病變發(fā)生關(guān)系密切，并在DN診斷及靶向治療方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。大量體內(nèi)外研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DN 患者或模型中，miRNA 異常表達(dá)可間接或直接影響炎癥通路NF-κB 活化，參與腎臟間質(zhì)纖維化改變［18］。miRNA中的miR-203在某些腫瘤發(fā)展中作為抑制因子，近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-203 的異常改變是引起臟器如心臟纖維化發(fā)展的重要原因［19］。LIU 等［7］發(fā)現(xiàn)miR-203 也與NF-κB 依賴的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)，且miR-203 可靶向作用于Toll 樣受體而間接影響NF-κB 活性，來參與DN 腎臟發(fā)展，提示干預(yù)miR-203 表達(dá)可能為緩解DN 炎癥-纖維化發(fā)展的重要機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，DN 大鼠及細(xì)胞模型中miR-203表達(dá)，異常低于正常大鼠及正常細(xì)胞，進(jìn)一步上調(diào)miR-203 表達(dá)后，大鼠及細(xì)胞DN 模型NF-κB 炎癥通路活化被抑制，促纖維化通路及細(xì)胞因子表達(dá)也顯著降低，證實(shí)上調(diào)miR-203 可通過抑制NF-κB 炎癥通路活化，來改善DN 腎臟炎癥-纖維化發(fā)展。

PEG3 為NF-κB 炎癥通路活化的上游重要調(diào)控因子。過往研究發(fā)現(xiàn)，PEG3 可通過腫瘤壞死因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活化來刺激NF-κB 活化而引起腫瘤微環(huán)境改變，來影響腫瘤發(fā)展［20］。近來研究發(fā)現(xiàn)敲低PEG3，可通過抑制NF-κB 活化來降低肝臟、腎臟及心臟纖維化，預(yù)示PEG3/NF-κB 通路在組織炎癥-纖維化病變過程中扮演重要角色［4-5，21］。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG3 在DN 大鼠腎組織及細(xì)胞模型中表達(dá)異常升高，且PEG3 與miR-203 之間有靶向結(jié)合位點(diǎn)，上調(diào)PEG3表達(dá)后，可部分逆轉(zhuǎn)miR-203高表達(dá)發(fā)揮的抑制NF-κB 活化、改善炎癥-纖維化等作用，提示miR-203 發(fā)揮抗DN 炎癥-纖維化作用，可能與靶向抑制PEG3/NF-κB通路活化有關(guān)。

綜上所述，miR-203 可靶向負(fù)調(diào)控PEG3/NF-κB通路，上調(diào)miR-203 表達(dá)，可靶向抑制PEG3/NF-κB通路活化，發(fā)揮抗DN 腎臟炎癥-纖維化病變。這為DN 的基因靶向治療提供一定思路。但PEG3 的上調(diào)并不能完全逆轉(zhuǎn)miR-203 的抗炎癥-纖維化作用，預(yù)示miR-203 還可能通過其他通路改善DN 腎臟損傷，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。