基于網絡藥理學分析冬蟲夏草防治急性腎損傷的分子機制①

洪 濤 李曉宇 李尚妹 劉華鋒③（廣東醫科大學附屬醫院腎內科，湛江 524000）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是多種原因造成的腎功能急性下降，是臨床常見危重癥。據報道，AKI 患病率為1.0%（社區）～7.1%（醫院），醫院獲得性AKI病死率為40%～80%，需要腎臟替代治療的AKI 病死率高達80%［1］。存活的AKI 患者部分經治療后逐步恢復腎功能，但仍有少部分AKI 患者病情遷延轉化為慢性腎臟病甚至演變為終末期腎臟病，需終身腎臟替代治療。可見AKI 已成為嚴重威脅公共健康的問題。

盡管近年針對AKI 發病機制、診斷等有許多研究，但防治方面并無突破。目前AKI 治療包括糾正可逆病因、維持液體電解質平衡、必要時腎臟替代治療等；尚無循證醫學證據顯示某個現代藥物防治AKI效果確切。近年中醫藥對AKI的防治研究取得了一些可喜進展。一些單味中藥及其提取物可用于AKI 的動物實驗或臨床研究，冬蟲夏草（Cordyceps sinensis，CS）是較早用于AKI 臨床及動物實驗的中藥之一［2］。

CS 味甘性溫，歸肺腎二經，具有補肺益腎作用。目前臨床多以人工發酵生產的菌絲體代替野生CS用于多種腎臟疾病治療。近年多個研究報道CS 在AKI 動物模型中具有減輕腎損傷的作用［3-4］。也有多篇CS 制劑在AKI 應用的臨床研究報道［5］。課題組前期曾做過AKI 患者CS 制劑的臨床應用效果系統評價，提示CS 制劑可改善AKI 患者腎功能，促進腎小管功能恢復，從而改善臨床治療效果［6］。本研究采用網絡藥理學方法挖掘CS 多成分、多靶點、多通路防治AKI 的分子機制，為進一步研究中藥防治AKI的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 CS 有效活性成分篩選 通過中藥系統藥理學數據庫和生物信息學分析工具TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php）篩選CS 的化學成分。根據TCMSP 數據庫建議的篩選條件（https：//old.tcmsp-e.com/load_intro.php？id=29）并參考既往文獻，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件［7-8］，得到CS的口服有效活性成分；同時查閱CNKI 及Pubmed 中關于CS的中英文文獻，得到其有效單體成分數據信息，最終確定CS口服有效活性成分納入后續分析。

1.2 CS 活性成分作用靶點預測 通過TCMSP 數據庫檢索以上活性成分對應靶點，并通過Uniprot（http：//www.uniprot.org）數據庫將靶點蛋白轉化為相應基因名。

1.3 AKI 相關疾病靶點數據構建 在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/home）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）4 個數據庫中檢索“acute kidney injury”，檢索人類AKI 相關基因，得到AKI治療靶點。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建 將CS成分靶點基因數據集與AKI相關靶點基因數據集進行對比分析，取二者重疊，得到CS 作用于AKI 的靶點數據集，并以Venn 圖形式繪制。通過STRING 數據庫（http：//string-db.org）構建CS 有效成分作用于AKI靶點的相互作用網絡圖。

1.5 藥物疾病靶網蛋白相互作用篩選 通過Cytoscape 3.8.0 對各味中藥“活性成分-AKI 疾病靶點網絡”蛋白互作關系進行分析，得到靶蛋白度值，篩選得到核心蛋白互作網絡圖。

1.6 基因功能聚類和富集分析 DAVID 是高通量的生物數據功能挖掘工具，旨在系統全面地為大規?；蚧虻鞍琢斜硖峁┥飳W意義，可對單個基因進行分析注釋構建GO 富集，包括生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC）。將CS 與AKI 共同靶點數據集信息導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO 富集分析，得到顯著富集的主要功能注釋。KEGG 數據庫整合了基因組、化學和系統功能信息，最核心的是KEGG PATHWAY數據庫，可利用圖形介紹眾多信號通路及各通路間的關系。將CS 與AKI 共同靶點數據集信息導入KEGG 數據庫（https：//www.kegg.jp）進行“藥物-AKI疾病作用靶點”通路富集分析，得到顯著富集的信號通路。

2 結果

2.1 CS有效活性成分篩選及靶點預測 在TCMSP數據庫中以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，得到CS有效化合物7 個：arachidonic acid（花生四烯酸，TCMSP 數據庫分子號：MOL001439）、Linoleyl acetate（乙酸亞油醇酯，TCMSP 數據庫分子號：MOL0-01645）、beta-sitosterol（β-谷甾醇，TCMSP 數據庫分子號：MOL000358）、Peroxyergosterol（過氧麥角甾醇，TCMSP 數據庫分子號：MOL011169）、cerevisterol（酒酵母甾醇，TCMSP 數據庫分子號：MOL008998）、cholesteryl palmitate（膽甾醇軟脂酸酯，TCMSP 數據庫分子號：MOL008999）、CLR（膽甾醇，TCMSP 數據庫分子號：MOL000953）；查閱既往文獻發現許多研究認為蟲草素是CS 的主要活性成分，具有抗腫瘤、免疫調節、保護腎臟等藥理學活性［9-11］。蟲草素及其異構體在TCMSP 數據庫中的分子編碼為MOL00-9000、MOL009001，OB 均>30%，但DL 分別為0.16及0.17，故以DL≥0.18 為篩選條件時未將其納入篩選結果，為避免遺漏重要成分，將這兩個分子一并納入分析。以上9 種有效活性成分中僅有6 種在TCMSP 中有對應作用靶點，其他3 個有效成分目前在數據庫中無對應靶點信息，對應靶基因共84 個（圖1）。

2.2 AKI 相關靶點數據構建 在DisGeNET 數據庫、GeneCards、OMIM、TTD 數據庫檢索人類AKI 相關基因，獲得AKI治療靶點信息。其中DisGeNET數據庫以Score≥0.8 為篩選條件得到1 148 個基因信息，GeneCards 以relevance Score≥1 得到7 149 個基因信息，OMIM 得到93 個基因信息，TTD 得到2 個基因信息。利用R 軟件將以上4 個數據庫所得AKI 相關靶標信息取并集，共得到7 370 個基因信息，Venn圖見圖2。

圖2 DisGeNET、GeneCards、OMIM、TTD 4 個數據庫的AKI相關靶基因數據集合Fig.2 AKI-related target genes got through DisGeNET，GeneCards，OMIM and TTD databases

2.3 CS-AKI共同靶點數據構建 使用R語言將CS的有效成分靶點基因數據集與AKI相關靶點基因數據集進行對比，取交集，得到CS 作用于AKI 的靶點數據集，共63個基因信息，Venn圖見圖3。

圖3 CS有效成分與AKI作用靶點交集Venn圖Fig.3 Venn diagram of CS bioactive components and AKI-related genes

2.4 CS活性成分-AKI相應靶點調控網絡構建 運用Cytoscope3.8.0 軟件構建中藥“活性成分-靶點”網絡，可見CS 中6 種有效成分通過網絡協同作用于63個靶標發揮對AKI的作用（圖1）。

2.5 CS-AKI 共同靶點的PPI 網絡構建與核心靶點篩選 將上述共同靶點導入String數據庫評估蛋白-蛋白互作信息，以相互作用分值可信度（interaction score confidence≥0.9）為篩選條件，隱藏與其他基因無相互作用的靶點，構建靶點蛋白-蛋白互作網絡圖（圖4），節點表示靶點蛋白，每條邊表示靶點蛋白間的相互作用，線條越多表示關聯度越大。借助Cytospace 計算連接節點數最多的基因，前10 位核心基因為RXRA、MAPK1、CASP3、CASP8、TNFRSF1A、RELA、JUN、PRKCA、TGFB1、PPARG，核心靶標網絡見圖5。

圖4 CS與AKI共同靶點的蛋白互作網絡Fig.4 Protein-protein interaction network of CS and AKI targets

圖5 CS與AKI核心靶點的網絡圖Fig.5 Network of CS and AKI core targets

2.6 GO 功能富集分析 將CS 作用于AKI 的靶點導入DAVID 數據庫平臺進行GO 富集分析，CS 對AKI 作用的BP 主要富集于細胞增殖調控、細胞凋亡、炎癥反應、衰老等（表1）。應用R 語言根據Enrichment score（-logP）對富集的前10 個BP、CC、MF進行柱狀圖可視化（圖6）。

表1 CS作用于AKI的GO聚類富集結果（前17位）Tab.1 GO enrichment of CS in treatment of AKI（Top 17）

圖6 GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis

2.7 KEGG 功能富集分析 將藥物與疾病交集靶點導入KEGG 數據庫進行KEGG 通路富集分析，共得到143條信號通路，主要富集通路見表2。對其中的PI3K-Akt 信號通路進行可視化以呈現靶點及其上下游分子的調控關系（圖7）。

表2 CS防治AKI的KEGG主要富集通路Tab.2 KEGG enrichment pathway of CS protecting AKI

圖7 PI3K-Akt信號通路中CS作用于AKI的靶點分布圖Fig.7 Target distribution map of CS acting on AKI in PI3K-Akt signaling pathway

3 討論

網絡藥理學近年已成為中藥藥理學的研究熱點，從分子水平預測藥物治療疾病的靶點、通路，揭示中藥治療疾病多通路多靶點起作用的復雜方式。本研究運用該方法分析CS防治AKI的分子機制，構建相應的“藥物-成分-靶點-疾病”作用網絡圖以及這些潛在靶點蛋白間相互作用的網絡圖，并對治療靶點進行了GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。CS 主要有9 種有效活性成分：TCMSP 數據庫分子號分別為MOL001645、MOL000358、MOL001439、MOL000953、MOL011169、MOL008998、MOL008999、MOL009000、MOL009001，通過63 個靶點發揮對AKI的防治作用。

本研究發現CS保護AKI的核心靶點主要包括：

RXRA、MAPK1、CASP3、CASP8、TNFRSF1A、RELA、JUN、PRKCA、TGFB1、PPARG，這些靶點可能通過影響對藥物的反應、信號轉導、衰老調控、細胞增殖和凋亡調控、炎癥反應、對缺氧的反應等參與AKI發生。

本研究發現CS 作用于AKI 的靶點富集通路主要包括：PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、細胞凋亡通路、TNF 信號通路、P53 信號通路、HIF-1 等，可能涉及細胞生長與凋亡、炎癥反應、細胞自噬、鐵死亡等多種生物學過程。其中PI3K-Akt 信號通路是富集程度較高的通路和關鍵信號通路。近期CS藥理作用及機制研究發現CS 可通過調控NF-κB 通路發揮抗腫瘤作用［12］；可通過抑制PI3K-Akt 通路調節腎小管上皮細胞凋亡［13］；通過調控mTOR 通路誘導腫瘤細胞凋亡和自噬［14］；通過Nrf2 調控HO-1 通路增強肺上皮細胞對缺氧的耐受性［15］。這些體內外研究報道與本研究結果一致，表明CS對腎臟保護作用的分子機制值得進一步研究和系統挖掘。

PI3K 是由調節亞基P85 和催化亞基p110 構成的二聚體，與生長因子受體結合可改變Akt 蛋白結構并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物，如凋亡相關蛋白Bad/Caspase9活性，從而調節細胞增殖、分化、凋亡及遷移等生物學行為。Akt 也可激活IKK，與NF-κB 通路存在交叉。PI3K/Akt 下游靶點為雷帕霉素靶蛋白（mTOR），而mTOR下游轉錄因子則包括HIF1α、c-Myc 等。抑癌蛋白PTEN 作為磷酸酶可使Akt去磷酸化而減少活化，阻止所有Akt 調控的下游信號傳導事件，是PI3K 的負向調控因子。近年大量研究發現PI3K/Akt/mTOR信號通路在腫瘤發生和治療具有重要作用［16-18］，也有報道其在阿爾茨海默病發生和治療中有重要作用［19］。本研究通過網絡藥理學分析推測CS 對AKI的防治作用可能與多條信號通路相關，其中PI3K/Akt/mTOR 信號通路是核心通路，與炎癥通路TNF、NF-κB 信號通路、MAPK 信號通路、細胞凋亡通路等均存在交叉相關，在AKI 中的作用及治療價值尚待進一步研究。

綜上，本研究從網絡藥理學角度發現了CS防治AKI 的主要有效成分和關鍵靶點，通過對作用靶點的GO 和KEGG 通路富集分析推測CS可能通過調節PI3K-Akt 信號通路等多條信號通路介導細胞凋亡、細胞自噬、鐵死亡、炎癥反應等病理生理過程，從而發揮對AKI的腎臟保護作用。但本研究單純從網絡藥理學角度對現有數據庫進行了挖掘，存在一定局限性，為后續進一步研究CS防治AKI的作用機制提供了理論依據。