IL-33及其受體ST2L在銀屑病患者外周血T細胞及皮損組織中的表達①

張麗麗 劉霄霄 孫瑞雪 王 菲 杜紅陽（錦州醫科大學附屬第一醫院皮膚科，錦州 121012）

銀屑病是一種由遺傳與環境共同作用誘發的免疫介導的慢性、復發性、炎癥性、系統性疾病。對患者的皮膚、心理健康甚至全身器官均可造成損害。目前其確切病因尚不清楚，但Th17 細胞及IL-23/IL-17軸在銀屑病發病機制中可能處于關鍵地位，并且針對IL-17A、IL-23、TNF-α 治療靶點的生物制劑已在臨床治療中廣泛應用。IL-33 是IL-1 細胞因子超家族成員，組成性地表達于多種人類組織細胞上，在皮膚組織細胞上呈現一定表達。其受體ST2 基因在結構上與其他IL-1 受體（IL-1R）相似，而ST2L是IL-33的跨模型受體。IL-33與ST2L結合，并與IL-1 受體輔助蛋白（IL-1RAcP）形成復合物結合后發揮重要的生物學功能。但目前IL-33 及其受體ST2L 在銀屑病患者和正常人表皮角質形成細胞、外周血T 細胞中的表達水平尚不清楚。因此，本研究分析了尋常型銀屑病和膿皰型銀屑病患者血清和皮損組織中IL-33 及其受體ST2L 的表達水平，旨在說明這些分子可能與銀屑病的發生發展有關，為未來尋找銀屑病的潛在治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選擇2022 年1 月至2022 年8 月在錦州醫科大學附屬第一醫院初次就診的尋常型銀屑病（PV組）患者20例和膿皰型銀屑病（PP組）患者20 例，同時收集20 例行體表色素痣切除者作為對照組（CON 組）。各組在年齡、性別上差異均無統計學意義（P>0.05）。PV 組和PP 組納入標準：①符合《銀屑病診療指南》尋常型銀屑病和膿皰型銀屑病的診斷標準，部分臨床表現不典型者行病理檢查，根據銀屑病典型組織病理改變進行確診；②近3 個月來未經任何系統和局部治療；③排除其他皮膚疾病、合并其他自身免疫性疾病或其他系統性疾病等。CON 組納入標準：無全身各系統疾病。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會同意，患者簽署知情告知書，倫理審批號：2022015。

1.1.2 主要試劑 人Jurkat T 細胞株（中國科學院上海細胞生物所）；HaCat 角質形成細胞（空軍總醫院中心實驗室）；兔抗人ST2L 抗體（Bioreagents公司）。

1.2 方法

1.2.1 皮損組織提取及處理 在銀屑病患者皮損區常規消毒后，用手術刀切取梭形皮膚組織，大小約1.5 cm×0.5 cm，取材深度0.2 cm～0.4 cm，縫合切口，對照組非皮損區按照同樣方法進行取材。將獲取的組織標本進行石蠟包埋制作石蠟切片。采用免疫組織化學Envision 2步法，操作方法按說明書進行。IL-33 和ST2L 抗體稀釋倍數均為1∶100，一抗4 ℃過夜。二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.2.2 Jurkat T 細胞和HaCat 角質形成細胞培養

Jurkat T 細胞置于T 細胞的培養液（RPMI 1640，15% 小牛血清、2%Na2CO3、1%HEPES、青霉素100 U/ml、慶大霉素100 U/ml），5%CO2、37 ℃、30%濕度條件下培養。HaCat 角質形成細胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的改良DMEM 培養基中，37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞單層鋪滿培養瓶后，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1 次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細胞圓縮時，DMEM 培養液終止消化，細胞收集于離心管中，600 g 離心5 min，棄上清，將細胞懸液分別移至冷凍管中，每管1.5 ml，將凍存管先置于4 ℃冰箱2 h，再移至-80 ℃低溫冰箱24 h，置于-196 ℃液氮中保存備用。

1.2.3 外周血T 細胞的分離 圓底試管中放入淋巴細胞分離液2 ml。在另一試管中加靜脈抗凝血（每毫升血液加20 單位肝素）2 ml，再加入同等量的Hanks 液使血液稀釋。用毛細吸管將抗凝稀釋的血液沿管壁滴入分離液試管中。放入離心機中，20 ℃條件下2 000 r/min 離心20 min。取出試管，將一毛細吸管伸入界面白色細胞層，將細胞吸出后移到另一試管中，加入1 ml Hanks液，懸浮細胞。

1.2.4 純化T 細胞 將全血加入1 個離心管中，加入抗凝劑，在800 g、4 ℃下離心15 min，將血漿吸取至另一個潔凈的離心管中，在56 ℃滅火30 min，再以相同的條件離心30 min，去除沉淀物，收集上清液完成分離。在一個潔凈的試管中，用0.9%NaCl 溶液稀釋全血，使其混合均勻，然后將上清液抽取到另一潔凈的離心管中，加入分離液，將稀釋過的全血鋪在分離液液面上部，在300～500 g、20 ℃下離心30 min，直到形成白膜層，將白膜層抽取至一離心管中，加入0.9%NaCl注射液稀釋至適當濃度，混合均勻后在400～500 g、20 ℃下離心10 min，棄上清液，再重復此過程，以清洗淋巴細胞；將細胞轉移至離心管中，加入磁珠分離液重懸，根據每1×107個細胞對應2～20 μl CD3 reagent 的比例加入所需CD3 Reagent，混合均勻，在4 ℃下靜置15 min，取出混勻后，在 300 g、20 ℃下離心10 min，棄上清液，加入磁珠分離液重懸，以此純化T 細胞，采用層析柱分離出來，完成T淋巴細胞的純化。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測經IL-17A 誘導后Jurkat T 細胞、HaCat 角質形成細胞、T細胞中IL-33、ST2L 蛋白表達水平 配制上層和下層膠并插入梳子，待膠凝固后加入5 μl 蛋白樣品和Marker 進行電泳，電泳結束后取出凝膠，剪相應大小的PVDF 膜，加入電轉液中進行電轉，牛奶封閉，加入IL-33（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化學發光法檢測目的條帶的灰度值，以目的蛋白與β-actin 灰度值比值作為蛋白表達水平。所有實驗重復3次。

1.2.6 RT-PCR 測定經IL-17A、IL-33 誘導后Jurkat T 細胞、HaCat 角質形成細胞中IL-33 mRNA 表達

提取培養48 h 后Jurkat T 細胞、HaCat 角質形成細胞和各組T 細胞總RNA，逆轉錄合成 cDNA，目的基因IL-33正向引物：5′-AATCAGGTGACGGTGTTG-3′，反向引物：5′-TGAAACACAGTTGGAGTGC-3′；ST2L正向引物：5′-CCCACATTCAATAGGACTG-3′，反向引物：5′-AAGAGGTGCTGTCCAGTTG-3′；GAPDH 正向引物：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′，反向引物：5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′。采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄得到cDNA。PCR 反應體系為25 μl，擴增條件為：95 ℃ 預變性 30 s，循環1 次；95 ℃ 變性5 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，95 ℃30 s，循環40 次。熔解曲線分析：將樣品放置在67 ℃中保溫15 s，接著以1 ℃/5 s 速度升溫至95 ℃。利用EASY Dilution 將cDNA 溶液按10、100、1 000、10 000、100 000 梯度稀釋（10 倍濃度稀釋）后，各取2 μl 進行Real-time PCR 反應。20 μl PCR 反應液中cDNA添加量分別相當于重100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg 的總RNA 逆轉錄得到的cDNA 量。通過使用實時定量PCR 對各組細胞中IL-33、ST2L 和GAPDH基因表達進行實時定量分析，采用雙標曲線法來評估相互關系。采用GAPDH 作為內參，各個樣品的同一個基因經過3 次重復實驗，并使用去離子水取代模板作陰性對照。計算出目的基因的相對表達量，采用2-ΔΔCt表示。

1.3 統計學分析 利用SPSS25.0 和GraphPad Prism 6 軟件對數據進行統計分析并制圖。采用Image J 軟件計算免疫組化圖片的光密度值和各種染色圖片中陽性細胞數，計量資料以表示。當某一組樣本量<5時，采用Fisher檢驗，結果方差齊兩樣本間比較采用t檢驗，多組間比較以方差分析q檢驗，相關分析采用Pearson 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果 在CON 組皮損組織中，IL-33蛋白僅少量表達于血管內皮細胞的細胞核中，表皮層中的角質形成細胞內無陽性表達，且ST2L 蛋白在CON 組的表皮角質形成細胞膜上無陽性表達，在真皮浸潤的細胞膜上有極少量表達；在PV組和PP組患者的皮損中，IL-33及其受體ST2L蛋白在表皮和真皮細胞中均有不同密度的陽性染色，見圖1。免疫細胞化學染色結果顯示，IL-33 蛋白主要在HaCat 角質形成細胞的細胞核和部分胞質有表達，見圖2。

圖1 免疫組織化學染色檢測各組皮損組織中IL-33及其受體ST2L表達Fig.1 Expressions of IL-33 and its receptor ST2L in each groups of skin lesions were detected by immunohistochemical staining

圖2 免疫細胞化學技術檢測HaCat角質形成細胞中IL-33的表達（×40）Fig.2 Expression of IL-33 in HaCat keratinocytes was detected by immunocytochemistry（×40）

2.2 Western blot 法檢測經IL-17A 誘導Jurkat T 細胞中IL-33 蛋白表達 不同濃度IL-17A 誘導Jurkat T 細胞表達IL-33 蛋白量不同，呈劑量依賴性，見圖3A；IL-17A（200 ng/ml）誘導Jurkat T 細胞表達IL-33蛋白量在24 h為最高，見圖3B。

圖3 Western blot 法檢測經IL-17A 誘導Jurkat T 細 胞中IL-33蛋白表達Fig.3 Expression of IL-33 protein in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by Western blot

2.3 Western blot 法檢測IL-17A 誘導HaCat 角質形成細胞IL-33 蛋白表達情況 不同濃度IL-17A 誘導HaCat 角質形成細胞表達IL-33 蛋白量不同，呈劑量依賴性，結果見圖4A。不同濃度IL-17A 誘導HaCat角質形成細胞的細胞核表達IL-33 蛋白量呈濃度依賴性，結果見圖4B。

2.4 Western blot法檢測各組T細胞中IL-33蛋白表達量 與CON 組比較，PV 組、PP 組T 細胞中IL-33蛋白表達量差異有統計學意義（P<0.01），其中PP組表達量明顯高于PV組，結果見圖5。

圖5 Western blot 法檢測各組和CON 組T 細胞中IL-33蛋白表達量Fig.5 Expression of IL-33 protein in T cells in each group was detected by Western blot

2.5 Western blot 法檢測IL-33 誘導Jurkat T 細胞后各組T 細胞中ST2L 蛋白表達情況 IL-33 誘導Jurkat T細胞后PV 組和PP組患者T細胞均可表達一定量ST2L 蛋白，呈劑量依賴性，見圖6；PV 組和PP 組中ST2L 蛋白表達高于CON 組在同一濃度IL-33 誘導產生的ST2L 水平；其中PP 組在IL-33（100 ng/ml）和IL-33（200 ng/ml）濃度誘導下產生的ST2L 水平均高于PV組。

圖6 Western blot 法檢測IL-33 誘導Jurkat T 細胞后各組T細胞ST2L蛋白表達量Fig.6 Expression of ST2L protein in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by Western blot

2.6 RT-PCR 檢 測IL-17A 誘 導Jurkat T 細胞后IL-33 mRNA 表達量 不同濃度IL-17A 誘導Jurkat T細胞后IL-33 mRNA 表達量不同，呈劑量依賴性，見圖7A；IL-17A（200 ng/ml）誘導Jurkat T 細胞后在24 h時IL-33 mRNA表達量最高，見圖7B。

圖7 RT-PCR 檢測IL-17A 誘導Jurkat T 細胞后IL-33 mRNA表達Fig.7 Expression of IL-33 mRNA in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.7 RT-PCR檢測IL-17A誘導后HaCat角質形成細胞中IL-33 mRNA 表達量 不同濃度IL-17A 誘導HaCat 角質形成細胞后IL-33 mRNA 表達量不同，且呈劑量依賴性，見圖8。

圖8 RT-PCR 檢測IL-17A 誘導HaCat 角質形成細胞IL-33 mRNA表達量Fig.8 IL-33 mRNA expression in HaCat keratinocytes induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.8 RT-PCR 檢測各組T 細胞中IL-33 表達情況PV組和PP組中IL-33 mRNA有明顯表達，PP組表達量高于PV組，且均高于CON組，見圖9。

圖9 RT-PCR檢測各組T細胞中IL-33表達量Fig.9 RT-PCR detected expression of IL-33 in T cells in each group

2.9 RT-PCR 檢測IL-33 誘導Jurkat T 細胞后各組T細胞中ST2L mRNA 表達情況 不同濃度IL-33誘導Jurkat T 細胞后PV 組和PP 組患者的T 細胞均可表達一定量ST2L mRNA，呈劑量依賴性，PV組和PP組中ST2L mRNA 表達高于在同一濃度CON 組IL-33誘導產生的ST2L mRNA 水平，見圖10A；以50 ng/ml終濃度IL-33 誘導各組細胞，從0 h 至12 h 各組細胞表達ST2L mRNA 呈上升趨勢，12 h 至24 h 呈下降趨勢，其中PV 組和PP 組表達ST2L mRNA 顯著高于同一時間點CON組水平，見圖10B。

圖10 RT-PCR檢測IL-33誘導Jurkat T細胞后各組T細胞中ST2L mRNA表達Fig.10 Expression of ST2L mRNA in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by RT-PCR

3 討論

銀屑病的確切病因尚未清楚，目前認為遺傳因素與環境因素相互作用，從而導致銀屑病發生或加重。TNF-α 和 IFN-γ 已被證實是銀屑病發病的關鍵因子，與疾病的嚴重程度具有相關性［1-2］。目前臨床上應用的生物制劑主要針對炎癥因子包括TNF-α、IL-12/23和IL-17A 等。為了發現更多的銀屑病治療靶點，本研究對IL-33/ST2L 在銀屑病發病機制的作用進行討論。

IL-33 是IL-1 家族的新成員，研究表明IL-33 在體內多種細胞中均可表達，其在皮膚組織細胞中高表達的特性受到關注；同時IL-33 在多種自身免疫性疾病的發病中起重要的作用，包括銀屑病、系統性紅斑狼瘡、特應性皮炎和系統性硬化癥等［3］。本研究結果表明，在PV 組和PP 組皮損中，IL-33 及其受體ST2L 蛋白在表皮和真皮細胞中有不同密度的陽性染色，與ZENG 等［4］、DONG 等［5］的研究結果一致。IL-33 通過與其受體ST2L 結合轉導信號于細胞內，其后通過下游的NF-κB 轉錄因子在細胞的增殖和分化中發揮重要的調節作用［6］。Th17 作為CD4+效應T細胞，可以分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等，研究發現IL-17A 是銀屑病生理發病機制的關鍵，IL-17A具有誘導趨化、抑制中性粒細胞凋亡、促進新生血管形成、促進活化的角質形成細胞產生更多趨化因子、促進其他細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）生成等作用［7］。IL-17A 能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌IL-6、IL-8 等炎癥因子。角質形成細胞核中表達IL-33 受到IL-17A 刺激后可以通過一定的調節機制，發揮減弱免疫反應的作用［8］。Jurkat T細胞是來源于T 淋巴細胞和急性T 細胞白血病的細胞株，在血液病研究、基礎免疫研究以及藥理學研究方面有重要的作用［9］。人永生化角質形成細胞（HaCaT）的增殖、凋亡和炎癥反應與銀屑病的發生發展關系密切［10-11］。本研究結果發現Jurkat T 細胞、HaCat 角質形成細胞在IL-17A 誘導下IL-33 蛋白和IL-33 mRNA 呈高表達。IL-33 被認為具有抗炎和促炎作用，IL-33/ST2 軸在自身免疫性疾病中可以促進炎癥細胞因子的釋放，但在糖尿病等一些代謝性疾病中，IL-33 可被認為其發揮了抗炎細胞因子的作用［12］。本研究中Jurkat T細胞、PV組、PP組T細胞在IL-33 誘導下ST2L 蛋白和ST2L mRNA 呈高表達，與DONG 等［5］的研究結果一致。這些結果說明IL-33及其受體ST2L 在銀屑病的發病機制中可能發揮了重要作用。

目前生物制劑治療銀屑病已取得良好的療效，但在生物制劑治療銀屑病的過程中，患者發生濕疹樣改變的情況也常有報道，其機制可能與免疫漂移、微生物定植、皮膚屏障破壞及遺傳因素有關［13］。既往研究顯示IL-33 及其受體ST2L 在AD 的發生發展過程中扮演重要角色，并且其在銀屑病中也起重要作用，但是否是生物制劑引起免疫漂移的分子機制有待進一步研究［14］。本研究初步證實了IL-33 及其受體ST2L表達與銀屑病發生發展密切相關，但在本研究中由于病例數量較少，尚未對關節病型銀屑病和紅皮病型銀屑病患者外周血T細胞和皮損進行相關檢測，故結果可能存在一定局限性，未來需要擴大樣本量，并且對各種類型銀屑病及其嚴重程度與IL-33/ST2L的相關性進行更加深入的研究。從而進一步明確IL-33/ST2L 受體與銀屑病的發生、發展的關系，探討其信號轉導通路，為治療銀屑病尋找新的靶點。