母B族鏈球菌定植致新生兒巨噬細胞相關細胞因子及免疫功能改變的研究

袁瑩瑩 劉海燕 郭 芳（廣州醫科大學附屬第二醫院新生兒科，廣州 510260）

B 族鏈球菌（colonization of group B streptococcus，GBS）感染作為一類于女性的消化道下端和生殖道正常定植的革蘭氏陽性球菌，又被稱為無乳鏈球菌［1］。在新生兒娩出的過程中，吸入或吞進GBS可引發嚴重的腦膜炎、肺炎、敗血癥，導致其發生神經系統相關的后遺癥，甚至死亡，也是當前國際公認可以誘發新生兒出現侵襲性感染的第一因素［2］。相關研究數據指出，有10%～30%孕婦中存在GBS感染，40%～70%的新生兒可能會感染GBS［3］。新生兒出現的GBS 感染主要有早發、晚發型兩種，早發疾病引起的新生兒病死率為11.1%，晚發疾病引起的新生兒病死率為27.8%［4］。T 淋巴細胞是機體免疫反應細胞，亦是人體中重要的調節免疫的細胞，能夠調節機體免疫功能，在機體正常情況下，體內CD4+/CD8+T 維持動態平衡，以保證機體免疫功能正常［5］。巨噬細胞屬于人體內的免疫細胞，巨噬細胞的主要功能為吞噬侵入體內的病原體、死亡細胞及死亡細胞釋放的內容物，并作為抗原提呈細胞激活T 細胞，機體對侵入的病原體做出免疫應答反應［6］。當新生兒感染GBS后，體內的T淋巴細胞對蛋白質、多肽抗原產生免疫應答，巨噬細胞因子能夠激活機體相關的免疫細胞，對抗GBS，進而引起體內細胞免疫功能改變［7］。既往對新生兒感染GBS的相關因素報道研究較多，但GBS 致新生兒巨噬細胞相關細胞因子及免疫功能改變的研究仍較少見。因此，本研究著重探討GBS 致新生兒巨噬細胞相關細胞因子及免疫功能改變的情況，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 取2020 年3 月至2022 年1 月廣州醫科大學附屬第二醫院收治的確診母GBS 定植的新生兒43例，設為研究組，納入標準：①依據美國2010 版CDC《圍產期GBS 預防指南》，對孕34～37 周婦女門診行GBS PCR 快速篩查，如陽性，則進一步培養宮頸分泌物，培養陽性納入標準；如培養陰性，但母合并胎膜早破>18 h，或體溫超過38 ℃，或患絨毛膜羊膜炎，考慮存在宮內感染可能，也納入本研究；②患兒家屬自愿參與；③進行GBS PCR 快速篩查前后均未進行抗生素治療。排除標準：①早產引起的呼吸窘迫；②合并心臟疾?。虎酆喜⒛[瘤；④患有院內感染；⑤合并其他類型感染；⑥拒絕參加。同期廣州醫科大學附屬第二醫院健康新生兒40 例為對照組。其中，研究組年齡0～10 d，病程3～10 d，體質量2 305～3 368 g；對照組年齡0～5 d，體質量2 380～3 472 g。兩組患兒的性別等一般資料差異無統計學意義（P>0.05），見表1。所有患兒的監護人均知曉此次試驗的方案且簽署知情同意書，該方案經過廣州醫科大學附屬第二醫院臨床研究與應用倫理委員會批準（2019-ks-KY-04）。

表1 兩組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between 2 groups

1.1.2 試劑與儀器 雙標記單克隆抗體CD3+/CD19+和CD4+/CD8+及紅細胞溶解均購自法國國際免疫公司。流式細胞儀（型號：MAX15036，貝克曼庫爾特公司）；雙標記單克隆抗體CD3+/CD19+和CD4+/CD8+試劑盒由美國的R&D 公司提供；相關趨化因子水平血清巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）、CXCL9、CXCL10、CCL3的試劑盒由美國的R&D公司提供。

1.2 方法

1.2.1 干預方法 孕期女性GBS 的確診手段：無菌聚酯纖維拭子（均為一次性使用）采集孕婦（孕周超過34 周）肛周和陰道的分泌物給予鑒定培養（選擇性GBS 培養平板培養）并將其他常見陰道病原菌排除（如支原體、衣原體等混合感染）。

研究組和對照組的新生兒出生時采集臍動脈血，檢測T淋巴細胞亞群水平、NK 細胞水平、趨化因子以及巨噬細胞相關的細胞因子濃度水平。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 檢測T 淋巴細胞亞群水平、NK 細胞水平 新生兒出生時采集臍動脈血2 ml，EDTA 抗凝處理后，2 000 r/min 離心5 min，分離細胞后，使用流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群水平（CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、CD3+CD4+T）以及NK 細胞水平。兩支試管中各加入100 μl EDTA 抗凝靜脈血，再分別加入20 pt 的雙標單克隆抗體CD3+/CD19+T 和CD4+/CD8+T，室溫避光孵育20 min后，加 500 μl 紅細胞溶解液溶解紅細胞15 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 緩沖液沖洗2 次，再以0.5 ml PBS 緩沖液懸浮細胞，流式細胞儀分析5 000 個細胞，嚴格按照相關的說明書步驟操作，批內和批間差異在10%、15%以內。

1.2.2.2 血清巨噬細胞相關細胞因子、相關趨化因子水平檢測 新生兒出生時采集臍動脈血2 ml，EDTA抗凝處理后，2 000 r/min 離心5 min，-80 ℃冰箱保存。采用Bio-plex 的懸液芯片多重檢測技術檢測血清巨噬細胞相關細胞因子血清中IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平；檢測相關趨化因子水平MIF、CX-CL9、CXCL10、CCL3。嚴格依照相關試劑盒的說明書步驟操作，將批內和批間差異10%、15%以內。

1.2.2.3 母GBS 定植的新生兒臨床表現 統計GBS 血流感染患兒臨床表現。臨床表現有發熱、氣促、反應差、血壓低、花斑紋、黃疸、抽搐等。

1.3 統計學方法 本研究數據采用SPSS26.0軟件分析，以［n（%）］代表計數資料，用χ2檢驗比較，組間兩兩對比用卡方分割法，以代表正態分布的計量資料，組間比較采用獨立樣本t檢驗比較，正態分布資料的相關性采用Person 相關性分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的T淋巴細胞亞群水平及NK細胞水平變化比較 研究組CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細胞水平均高于對照組，CD3+CD4+T低于對照組（P<0.05）。此結果說明母GBS定植對其T 淋巴細胞亞群水平及NK 細胞水平具有一定影響，見表2。

表2 T淋巴細胞亞群水平及NK細胞水平變化比較（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

表2 T淋巴細胞亞群水平及NK細胞水平變化比較（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

2.2 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平 兩組IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平進行對比，研究組患兒IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平均高于對照組（P<0.05）。母GBS 定植新生兒的IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平明顯較高，見表3。

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比較（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比較（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

2.3 巨噬細胞相關趨化因子水平 兩組巨噬細胞相關趨化因子對比，研究組患兒MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于對照組（P<0.05）。此結果亦說明母GBS 定植新生兒與健康新生兒進行對比，MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平呈現異常升高的趨勢，見表4。

表4 巨噬細胞相關趨化因子比較（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

表4 巨噬細胞相關趨化因子比較（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

2.4 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相關趨化因子、細胞免疫功能與新生兒GBS感染相關性分析 Person 相關性分析顯示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 與新生兒GBS 感染呈正相關，CD3+CD4+T 水平與新生兒GBS 感染呈負相關（P<0.05）。見表5。

表5 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相關趨化因子、細胞免疫功能與新生兒GBS感染的相關性分析Tab.5 IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10，related chemokines，cellular immune function and neonatal GBS infection

2.5 母GBS 定植的新生兒臨床表現 對母GBS 定植新生兒的臨床表現進行追蹤，發現43例新生兒出現呼吸窘迫4例，休克1例，敗血癥2例，腦膜炎1例，胃液培養陽性2 例。在經過臨床對癥治療后，研究組均治愈出院。

3 討論

GBS自從1938年被首次報告，直至1970年才被認為是新生兒敗血癥、腦膜炎以及肺炎的主要致病菌［9］。歐美國家GBS 比較常見，是誘發新生兒出現嚴重的感染菌群之一，亦被列為細菌感染新生兒的第一位致病菌［10］。GBS 感染具有患病率高、病死率高、致殘率高的特點，臨床表現多為肺炎、呼吸衰竭、高熱等。早發型GBS 感染以肺炎、肺動脈高壓和菌血癥為主要的特征，隨著疾病的不斷發展，新生兒敗血癥后期可發生心肌功能障礙血壓下降、彌散性血管內凝血、周圍中性粒細胞減少等［11-12］。國外報道指出，近20年來，美國、英國等歐美國家出現GBS 感染最高的人群即是新生兒，其具體的發生率61%、28%，病死率超過2成［13-14］。近年來，隨著我國生育政策的調整，我國每年新生兒人數不斷增多，新生兒GBS 感染發病率也不斷上升。新生兒GBS感染的主要途徑則是母嬰感染，大部分是新生兒分娩期間接觸了母體產道存在的細菌或者是羊膜早破誘發的各種上行感染［15］。

胚胎期T 淋巴細胞的來源大多是肝和卵黃囊，正常人體的T 淋巴細胞來源于骨髓的多能干細胞，在新生兒時期，骨髓里面少量的多能干細胞向著胸腺內遷移，之后在胸腺激素的刺激下分化、成熟，轉變為具有一定免疫活性的T細胞［16］。巨噬細胞主要由單核細胞分化產生，是一類定制在組織內部的白細胞，其能夠分泌很多類型的酶及各種活性因子，包括血小板的衍生物生長因子、白細胞介素、多肽轉換的生長因子以及腫瘤壞死因子等［17］。機體發生炎癥反應時，體內的巨噬細胞主要用于機體損失位置組織、病原體的清除等，促進機體的創傷愈合。本次研究中，研究組CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細胞水平均高于對照組，CD3+CD4+T低于對照組。分析認為：新生兒GBS 感染后，促進了體內炎癥反應，而T 淋巴細胞作為免疫活性T細胞，在清除體內病原體的同時，刺激大量CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T 產生，進一步導致感染GBS的新生兒體內T淋巴細胞水平異常。研究組患兒IFN-γ、MIF、IL-4、IL-10、IL-13、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于對照組。對于感染GBS 的新生兒，其體內成熟的T 細胞可以通過血流移動到外周免疫的各個器官，經過多個組織進行再循環，發揮免疫調節以及細胞免疫作用，同時T 細胞的再循環則可加強免疫應答，對抗GBS［18］。GBS 進入生殖道向上到宮內，導致新生兒感染GBS，而上皮細胞是抵御病原菌的第一道防線，巨噬細胞可以吞噬并消滅外部的病原菌，刺激機體各種細胞因子不斷地釋放，在新生兒的身體中，巨噬細胞接觸IFN-γ 后，產生炎癥因子，激活巨噬細胞殺死病原菌的能力并提高其抗原具體的提呈能力，促進炎癥細胞因子IL-10、IL-4、IL-13 分泌，殺滅入侵的病原體，從而抑制體內的炎癥反應［19］。三磷酸甘油醛脫氫酶位于GBS 表面，可以誘導巨噬細胞實施吞噬行為，促進IL-4、IL-10 因子的分泌，在GBS 血流感染患兒體內發揮抗炎作用。

結合本研究結果，Person相關性分析顯示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 與新生兒GBS 感染呈正相關，CD3+CD4+水平與新生兒GBS 感染呈負相關（P<0.05）。側面證實了新生兒GBS 感染與巨噬細胞相關細胞因子、T 淋巴細胞亞群水平存在顯著相關性，對于在產前確診母GBS 定植的新生兒，可以盡早檢測巨噬細胞相關細胞因子、T 淋巴細胞亞群水平，從而為臨床上治療、評估新生兒GBS 感染提供診斷依據。新生兒出現4例呼吸窘迫，休克1例，敗血癥2例，腦膜炎1例，胃液培養陽性2例。研究組均治愈出院。

研究結果證實，對于新生兒GBS 感染患兒盡早采取針對性的干預措施，能有效地改善患兒預后，降低患兒發生呼吸窘迫、休克、腦炎等并發癥的風險。

綜上所述，巨噬細胞相關細胞因子及T 淋巴細胞亞群水平參與了新生兒GBS 感染的免疫應答過程，巨噬細胞相關細胞因子及細胞免疫功能改變與新生兒GBS 感染相關。孕晚期母GBS PCR 篩查有利于識別早發型GBS 感染。受樣本量限制，本研究結果有待擴大化的中心試驗證實。