博來霉素誘導系統性硬化病小鼠腸道菌群改變及醋酸潑尼松龍的干預作用①

張 羽 周雪艷 趙亮娟 李 凱 呂軍影（廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧 530021）

系統性硬化病（systemic sclerosis，SSc）簡稱硬皮病，是一種結締組織自身免疫性疾病，以皮膚、關節、內臟器官（如肺、胃腸道、心臟）的炎癥及進行性纖維化為主要特征，病理表現為血管損傷和真皮中大量膠原蛋白過度積聚［1-3］。SSc 發病率為3～24 例/每10 萬，好發于20～60 歲女性，可分為局限性SSc（lcSSc）和彌漫性SSc（dcSSc）兩種類型，其中dcSSc死亡風險更高［4-6］。SSc 目前尚無特效治療藥物。SSc 的發生發展由免疫功能紊亂引起，但確切病因和發病機制尚不清楚。近年腸道菌群對人體生理、病理及疾病的影響日益受到關注，越來越多的研究表明，多種自身免疫性疾病如類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA）、系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、多發性硬化（multiple sclerosis,MS）和炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）的發生發展均與腸道菌群失衡有關［7-10］。但目前對屬于自身免疫性疾病之一的SSc 與腸道菌群的相關研究較少。因此，本研究擬運用16S rRNA 測序技術等探討SSc 腸道菌群變化及SSc 常用治療藥物——糖皮質激素（glucocorticoid，GCs）對其的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源及分組 6周齡雄性SPF級BALB/c小鼠，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產批號：SCXK（湘）2016-0002，動物使用批號：SCXK（桂）2014-0003。動物飼養溫度：（25±2）℃，相對濕度為（50±5）%，普通適應性飼養1 周后隨機分為對照組（Control）、SSc 模型未用藥組（Model）、SSc模型醋酸潑尼松龍治療組（Pred），每組12 只。本研究經廣西醫科大學實驗動物倫理委員會批準（編號：201809031），整個實驗程序符合《動物實驗管理條例》。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 注射用鹽酸博來霉素（BLM，15 mg/瓶，浙江漢輝藥業有限公司，批號：H20055883）；醋酸潑尼松龍片（PAT，5 mg/片，浙江仙居藥業有限公司，批號：H33021207）；Sirius Red染色試劑盒（武漢博士德生物公司）；DNA 提取試劑盒、DNA 純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；高保真PCR 預混液（批號：M0532S，美國NEB公司）；T100 梯度PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；電泳裝置DYY-6C（北京市六一儀器廠）；Invitrogen qubit 3.0 分光光度計（美國Invitrogen 公司）；Agilent 2100生物分析儀系統（美國Agilent 公司）；NovaSeq 6000測序儀（美國Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 SSc 小鼠模型構建與藥物干預 依據文獻［11］，采用BLM 誘導SSc 小鼠模型。剔除各組小鼠背部相同區域面積約1.5 cm×1.5 cm 被毛，皮下注射0.1 ml 磷酸BLM 緩沖液（200 μg/ml），建立SSc 小鼠模型。模型成功標準：BALB/c 小鼠連續4 周每日皮下注射BLM 后誘導皮膚硬化和皮膚增厚，組織學表現為膠原束增粗、均質化，肺纖維化誘導形成，膠原在肺內積累。本研究共獲得24 個成功模型。Control 組皮下注射等體積PBS（0.01 mol/L）。造模期間，根據動物與人體表面積劑量折算表計算Pred組小鼠灌胃醋酸潑尼松龍藥液（0.45 mg/ml）等效劑量為0.2 ml，Control 組和Model 組分別給予等劑量生理鹽水灌胃。以上操作1次/d，連續28 d。

1.2.2 樣品采集與處理 第28 天末次給藥結束后，禁食禁水12 h，收集每只小鼠新鮮糞便5～8 粒，放入滅菌PE 管，-80 ℃超低溫保存，以備腸道菌群16S rRNA 基因測序。實驗結束第2 天，麻醉處死小鼠，留取皮膚、肺組織分裝于凍存管，用于Sirius Red染色。

1.2.3 一般生存狀態 造模期間每天觀察記錄各組小鼠精神狀態、飲食及形體變化、活動能力、被毛生長情況、皮膚彈性及硬度。

1.2.4 病理觀察 根據文獻［12］，Sirius Red 染色觀察各組小鼠皮膚、肺組織病理改變，測定組織膠原纖維含量。

1.2.5 16S rRNA 測序技術檢測 參考文獻［13］，使用基因組DNA 提取試劑盒提取糞便樣品中（200 mg）細菌基因組DNA。以細菌基因組DNA 為模板，分別以341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）作 為正向和反向引物擴增16S rRNA 基因V3-V4高變區。擴增體系30 μl：15 μl Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、3 μl 引物、5～10 ng DNA模板和12 μl H2O。擴增過程：98 ℃初始預變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；最終72 ℃延伸5 min。DNA 純化試劑盒純化等質量混合物PCR 產物，TruSeq DNA PCR-Free高通量文庫制備試劑盒構建文庫，Invitrogen Qubit 3.0 分光光度計和Agilent 2100 生物分析儀系統評估DNA 文庫質量。Illumina NovaSeq 6000 平臺進行雙端測序（2×250，PE250），使用FLASH 進行合并reads，Qiime 進行質量過濾。通過截斷低質量堿基和篩選高質量堿基，過濾后的Tags 序列與Gold 數據庫對比，UPARSE 軟件7.0.1001 進行操作分類單位（OTU）聚類，一致性為97%，再利用UCHIME 對嵌合體序列進行鑒定和去除，獲得有效Tags。使用Silva 16S rRNA 數據庫的RDP 分類器算法分析對應各16S rRNA 基因序列分類群，置信閾值為70%（以上操作均在廣西普斐信息科技有限公司實驗室進行）。

1.3 統計學分析 所有數據采用表示，采用SPSS23.0 軟件進行統計學分析。數據具有正態性且方差齊時，采用t檢驗，方差不齊時采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般生存狀態 造模前各組一般情況無差異。Control 組小鼠精神良好，動作靈活敏捷，活潑好動，食量正常，體形發育正常，體毛光亮順滑，生長迅速，背部皮膚結構完整，皮膚柔軟彈性好，無死亡。造模后，Model 組小鼠精神萎靡，反應遲鈍，行動緩慢，活動減少，進食減少，體形逐漸消瘦，被毛暗淡無光澤，體毛無新長，背部皮膚增厚粗糙、硬化，與皮下組織粘連，部分出現結痂現象。Pred 組小鼠精神狀態好轉，行為能力稍恢復，但動作仍緩慢，較安靜，食量增加不明顯，體形仍偏小，被毛缺乏光澤，體毛基本無再生，背部皮膚粗糙、硬化及結痂情況明顯改善，彈性逐漸恢復（圖1）。

圖1 各組小鼠一般生存狀態Fig.1 General survival status of mice in each group

2.2 皮膚、肺組織病理學指標 Control 組小鼠皮膚組織未見明顯病理改變，皮膚膠原纖維排列規整，形態結構完整，未出現紊亂現象；與Control 組比較，Model 組小鼠皮膚成纖維細胞及膠原纖維明顯增加，出現較多纖維束，形態較粗，結構紊亂，相互纏繞螺旋排列，肺組織紅色膠原纖維明顯增多、沉積，肺泡間隔增大、增多，肺組織正常結構損壞，伴有形狀不同、大小不等的結節和條索樣改變，呈彌漫性肺纖維化表現。醋酸潑尼松龍干預后，Pred 組小鼠皮膚和肺組織成纖維細胞及膠原纖維明顯減少，可見少量纖維束形成，形態變細，部分組織疏松呈網狀，纖維結構排列逐漸恢復有序、規則。肺泡間隔縮小、減少，肺組織破壞程度、彌漫性肺纖維化程度均改善（圖2）。

圖2 各組小鼠皮膚和肺組織Sirius Red染色Fig.2 Sirius Red staining of skin and lung tissues of mice in each group

2.3 皮膚、肺組織膠原纖維含量變化 Control 組小鼠皮膚及肺組織膠原纖維含量正常；與Control 組比較，Model 組小鼠皮膚、肺組織膠原纖維含量明顯增加（P<0.01）。與Model組比較，Pred組皮膚、肺組織膠原纖維含量明顯降低（P<0.01，圖3）。

圖3 各組小鼠皮膚及肺組織膠原纖維含量Fig.3 Contents of collagen fibrils in skin and lung tissues of mice in each group

2.4 OTU 物種注釋 共得到4 311 212 個原始讀數，過濾后剩余3 477 520個讀數。對36個樣本序列進行分析聚類，篩選頻數最高的代表序列共1 542個OTU。使用GraPhlAn 結合OTU Table 對各分組樣本分別進行單獨OTU 物種注釋，以總體報告形式展示優勢菌種（圖4）。Control 組優勢菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）；Model 組優勢菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）；Pred組優勢菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。

圖4 基于GraPhlAn的OTU注釋結果等級樹圖Fig.4 GraPhlAn based hierarchical tree plot of OTU annotation results

2.5 α 多樣性分析 物種累積箱形圖可用于描述樣本量增加與新物種出現速度的關系，是評價樣本量充分與否以及物種豐富度的有效工具。橫坐標表示樣本量進一步加大，箱形圖位置逐漸趨于平緩，表明樣本量對該環境中的物種增加產生影響較小，提示樣本量充分，物種足夠豐富（圖5）。

圖5 物種累積箱形圖Fig.5 Species cumulative box plot

分別對三組及兩組間進行聚類分析（圖6），三組共有OTUs 575 個。Control 組與Model 組共有OTUs 610個，其中Control 組特有OTUs 735 個，Model 組特有OTUs 56 個；Control 組與Pred 組共有OTUs 620 個，其中Control 組特有OTUs 725 個，Pred組特有OTUs 53 個；Pred 組與Model 組共有OTUs 606 個，Pred 組特有OTUs 67 個，Model 組特有OTUs 60個。

圖6 韋恩圖Fig.6 Venn diagram

Observed_species 指數表示實際觀測到的OTU數，反映物種豐富度信息；PD_whole_tree 指數可顯示微生物群落系統遺傳多樣性。Model組Observed_species 和PD_whole_tree 指數顯著低于Control 組（P<0.01），而Pred 組與Model 組差異無統計學意義（P>0.05，圖7、表1）。

表1 腸道菌群多樣性指數分析（，n=12）Tab.1 Analysis of diversity indexes of intestinal flora（，n=12）

表1 腸道菌群多樣性指數分析（，n=12）Tab.1 Analysis of diversity indexes of intestinal flora（，n=12）

Note：Compared with Control group，1）P<0.01.

圖7 Alpha多樣性箱型圖Fig.7 Alpha diversity boxplots

2.6 β多樣性分析

2.6.1 主成分分析（PCA）及無度量多維標定法（NMDS）分析 Model 組與Control 組各點間距離較遠，菌群組成差異較大；Model 組與Pred 組樣品距離較近，菌群組成較為相似，第一主成分對樣品差異的貢獻值為16.72%，第二主成分對樣品差異的貢獻值為13.87%（圖8A）。NMDS 分析顯示，Stress=0.073，樣本組成差異顯著。Control 組與Model 組各點距離較遠，樣本間物種組成存在顯著差異；Model組和Pred 組間各點距離較近，物種組成差異較小，Control組與Pred組物種組成差異較大（圖8B）。

圖8 PCA及NMDS分析圖Fig.8 PCA and NMDS analysis plots

2.6.2 門和屬水平微生物區系組成比較 組間T-test 評估腸道菌群在門和屬水平上組間差異顯著（P<0.05）的物種，Control 組相比，Model 組變形桿菌門（Proteobacteria）豐度明顯偏高；而酸桿菌門（Acidobacteria）僅在Control 組富集。與Model 組相比，醋酸潑尼松治療后，放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）豐度顯著降低。與Control組相比，Pred組中厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）豐度偏高，擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）豐度偏低，酸桿菌門（Acidobacteria）缺乏（圖9A）。屬水平物種比較表明，與Control 組比較，Model 組擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）豐度均值顯著降低（P<0.05）；螺桿菌（Helicobacter）、瘤胃梭菌屬_6（Ruminiclostridium_6）、文肯菌屬（Rikenella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、瘤胃菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）豐度均值顯著升高（P<0.05）。醋酸潑尼松干預治療后，與Model 組比較，Pred 組藍綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）豐度均值升高（P<0.05）；別樣桿菌屬（Alistipes）、文肯菌屬（Rikenella）、瘤胃菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Candidatus_Saccharimonas豐度均值降低（P<0.05）。與Control 組比較，Pred 組小鼠腸道螺桿菌（Helicobacter）、藍綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、未確定的瘤胃菌科（unidentified_Ruminococcaceae）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）、支原體菌屬（Mycoplasma）、顫桿菌屬（Oscillibacter）豐度均值顯著升高（P<0.05），纏結優桿菌（Eubacterium_nodatum_group）、Marvinbryantia、瘤胃菌科_NK4A214_組（Ruminococcaceae_NK4A214_group）豐度均值顯著降低（P<0.05，圖9B）。

2.6.3 組間特征差異物種比較 線性判別分析LEfSe（LDA Effect Size）尋找組間差異顯著的物種，即Biomarker，具有高維生物標識特點。LDA 值分布柱狀圖展示，門水平上，Control 組小鼠腸道富集擬桿菌門下的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）（倍變化評分分別為4.2 和4.125，圖10A）；與Model 組對比，Pred 組普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）豐度差異最大（倍變化評分為4.3，圖10B）。與Control 組對比，Pred組厚壁菌門下的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）豐度差異最大（倍變化評分均為4.65），而Control 組豐度差異最大的為擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌目（Bacteroidales）、擬桿菌科（Bacteroidetes）、擬桿菌科_S24_7_組（Bacteroidales_S24_7_group）（倍變化評分為4.6、4.6、4.6 和4.7，圖10C）。

圖10 組間LDA值分布柱狀圖及進化分支圖Fig.10 LDA score bar graphs and evolutionary cladogram between groups

3 討論

SSc 是一種病因和發病機制尚不明確的難治性自身免疫性疾病。研究報道，多種環境因素（感染因子、血管損傷、免疫異常、化學暴露和維生素D 缺乏）及遺傳易感性驅動SSc發病，其中免疫異常被認為與SSc關系最為密切［14-16］。近年研究表明，腸道菌群失衡可導致腸道黏膜損傷、免疫功能紊亂，出現炎癥細胞因子IL-6、IL-17 和TNF-α 等過表達誘發慢性炎癥，持續慢性炎癥誘發結締組織免疫性疾病，累及全身多個器官或組織［17-18］。腸道菌群與自身免疫性疾病的關系已成為當下研究熱點。

正常情況下，菌群維護腸道黏膜屏障，對機體免疫、生長發育和代謝起重要調節作用［19］。一旦菌群在定植部位發生豐度、多樣性、結構及生物特性改變，平衡即被打破進而誘發疾病［20］。許多疾病進程及轉歸均與腸道菌群關系密切，LU 等［21］研究2 型糖尿病時發現腸道菌群失衡是胰島素抵抗進展的重要危險因素。聶源等［22］研究肝癌與腸道微生態關系時也得到了同樣結論。研究顯示自身免疫性疾病與腸道菌群失衡有重大關系，RA、SLE 是菌群失調引起的異常免疫應答［23-25］。目前關于自身免疫性疾病與腸道菌群失調的關系研究主要集中于強直性脊柱炎、自身免疫性胰腺炎和克羅恩病等疾病，對SSc與腸道菌群的研究很少［26-28］。根據以上研究及SSc發病特點，推測SSc發生發展可能也與腸道菌群失調有關。本研究運用16S rRNA 基因測序技術對博來霉素誘導的SSc 小鼠腸道菌群狀況進行觀察，同時觀察了SSc 常用藥物GCs（醋酸潑尼松龍）在治療SSc小鼠過程中對腸道菌群的影響。

本研究采用BLM 誘導SSc 小鼠模型，這一建模方法最先由YAMAMOTO 等［29］于1999 年建立，具有與人類SSc 皮膚、肺組織學特征相似的特點，是目前學界公認的SSc 模型之一。實驗發現造模后小鼠出現精神差、活動慢、進食少、體型瘦小及皮膚明顯硬化等生存狀況不佳表現。病理發現皮膚、肺組織成纖維細胞及膠原纖維明顯增多，纖維束增粗，結構排列紊亂；肺泡間隔增大、增多，肺組織正常結構損壞，伴有彌漫性肺纖維化表現，符合SSc 模型特征，與人體SSc 臨床表現及病理改變基本一致。潑尼松龍能改善小鼠一般生存狀況及病理表現，皮膚、肺組織膠原蛋白含量改善最為明顯。

16S rRNA 細菌基因測序技術是通過對細菌16S rRNA 基因可變區進行特異性引物設計，利用高通量測序平臺對不同樣品進行高通量測序，獲得16S rRNA 基因序列，比對基因庫數據分析環境樣本中細菌的技術，目前廣泛用于腸道菌群譜鑒定分析。本研究發現，Model組與Control 組小鼠比較，腸道菌群發生明顯變化，通過Observed_species 和PD_whole_tree 指數圖發現腸道菌群豐富度、系統譜系多樣性顯著下降；通過韋恩圖、PCA 及NMDS圖分析發現Model組小鼠菌群組成結構與Control組小鼠存在顯著差異；通過GraPhlAn 圖、T-test 圖得到兩組間門及屬水平上豐度差異顯著的大量具體物種；通過LEfSe 圖獲得組間最具特征性差異的生物標志物。菌群這些改變可能參與SSc 發病及發展過程。變形菌門（Proteobacteria）包括很多病原菌屬，在Model 組中豐度異常升高，可通過腸道運輸至體循環，啟動免疫細胞，影響遠端器官炎癥/纖維化反應，與ANDRéASSON 等［30］近期對瑞典隆德大學、美國加利福尼亞大學洛杉磯分校的兩組SSc 患者糞便菌群研究結論相似。瘤胃梭菌屬_6（Ruminiclostridium_6）為致病菌，研究證實其豐度顯著升高可加速高脂飲食導致的動脈硬化合并RA 疾病進展［31］。文肯菌屬（Rikenella）豐度比例與甲狀腺功能亢進引起的代謝異常程度呈正相關［32］。螺桿菌（Helicobacter）介導局部炎癥及免疫應答，誘發宿主免疫損傷，與消化道疾病、免疫性疾病有關，其中幽門螺桿菌（H.pylori，HP）、肝螺桿菌是引起消化性潰瘍、胃癌、肝癌的病原菌，且在HP 感染自身免疫性疾病包括SSc患者比例普遍偏高［33］。RADI? 等［34］研究表明HP 陽性與SSc 患者中皮膚及內臟臨床受累程度有關，與疾病嚴重程度評分呈正相關，Model 組腸道中這些致病菌豐度顯著升高可能與SSc 發病密切相關。擬桿菌屬（Bacteroides）在Model 組豐度降低，與VOLKMANN等［35］報道加州大學洛杉磯分校17例SSc門診患者研究結果一致，豐度低可導致免疫功能紊亂、內源性感染而致??；研究報道，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是益生菌，可保護腸道黏膜屏障，通過調控炎癥因子維持機體適度免疫，豐度低下可導致Th1/Th2 失衡，誘發RA［36］。本研究中Model 組其豐度降低，進而打破免疫平衡，促發自身免疫異常而致病。普雷沃氏菌_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）豐度與抗炎因子呈正相關，與促炎因子呈負相關［37］。Model 組小鼠皮膚、肺部炎癥浸潤可能與其豐度顯著降低有關；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）作為維持健康小鼠腸道微生態平衡的生物標志物，能維持腸道正常通透性及屏障功能，其豐度下降可導致免疫活性增加進而引發自身免疫病［38］。瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）、羅斯氏菌屬（Roseburia）可產生短鏈脂肪酸（SCFA），參與炎癥反應和腸黏膜免疫，調控腫瘤免疫［39］。研究表明，瘤胃球菌科_UCG-005數量減少會加劇炎癥性腸病、胃癌癌前病變進程，而豐度過高促使肝細胞損傷誘發癌變［40-41］。羅斯氏菌屬在一定條件下具有抗炎作用，在慢性風濕性疾病、特發性關節炎等疾病中豐度持續下降，但在非病毒性肝細胞肝癌患者腸道中豐度顯著升高［42-43］。因此，Model組這些條件致病菌豐度顯著升高，可能與SSc 持續慢性炎癥病變最終導致免疫功能失調有關。

GCs 是SSc 常用治療藥物，一般認為GCs 治療SSc 的機制主要是抗炎、免疫抑制及抗纖維增生，GCs 對腸道菌群的影響研究較少，尤其是對SSc 腸道菌群的影響尚未見報道。本研究觀察GCs藥物醋酸潑尼松龍對SSc 小鼠治療效果的同時，也觀察了對SSc 小鼠腸道菌群的影響，發現醋酸潑尼松龍治療過程中可有效改善SSc 小鼠一般生存狀態及皮膚和肺組織纖維化程度，治療28 d 后，腸道菌群也發生一系列變化。普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）（Biomarker）在Pred組豐度回調。既往研究表明，別樣桿菌屬（Alistipes）可致炎癥和腫瘤，驅動人類結腸炎和結直腸癌發病［44］；Pred 可下調其豐度抑制炎癥反應和過度免疫應答。藍綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）均為產丁酸鹽菌，具有抗炎作用，在Pred 組豐度顯著增加可能發揮積極抗炎作用［45-48］。雙岐桿菌屬（Bifidobacterium）是公認的益生菌，為腸道提供酸性環境，維持腸道正常免疫功能，MS 狀態下，豐度降低導致Th17 過度激活，免疫耐受失控而發?。?9］。另有報道，Candidatus_Saccharimonas腸道豐度顯著升高有利于減輕腸道炎癥損傷，參與免疫調節及腸道修復［50］。實驗中還觀察到Pred 組與Control 組比較，致病菌螺桿菌（Helicobacter）、支原體菌屬（Mycoplasma）豐度顯著升高［51］。推測Pred 對上述有益菌屬及致病菌豐度的逆向調節可能與激素治療后出現腸道屏障破壞、菌群失調導致腸道炎癥反應加重、炎癥刺激自身抗原暴露、繼發自身免疫性疾病等副作用有關［52］。同時，Pred 組厚壁菌門的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、未確定的瘤胃菌科（unidentified_Ruminococcaceae）豐度顯著增多，有益菌Marvinbryantia、瘤胃菌科_NK4A214 組（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、擬桿菌科_S24_7 組（Bacteroidales_S24_7_group），致病菌纏結真桿菌Eubacterium_nodatum_group豐度顯著降低［53-56］。Pred 對模型小鼠腸道各分類細菌群的豐度調節與Control 組存在明顯差異，Pred 組小鼠腸道菌群豐富度、譜系多樣性有一定程度改善，但菌群組成結構與Model組相似，醋酸潑尼松龍無法完全恢復小鼠腸道微生態，可能是無法達到最佳SSc 治療效果的原因之一。提示醋酸潑尼松龍有限影響了SSc 小鼠失衡的腸道菌群譜，但并不能根本改善SSc 小鼠失調菌群。研究結果給SSc 治療帶來了一些啟示，應用GCs 治療SSc 過程中尚需注意糾正腸道菌群失調狀態，聯用能夠調控腸道菌群紊亂的藥物和/或微生物制劑修復菌群失衡可能有利于提高SSc治療效果。

本研究的局限表現為樣本量小及缺乏時間縱向研究。盡管樣本量小，本研究觀察到了一些顯著關聯，表明本研究結果不是偶然的。此外，觀察到疾病表型影響，尚未研究至分子水平，對菌群與SSc病程中炎癥及纖維化的直接或間接聯系以及激素通過菌群對SSc的分子調控機制有待進一步研究。