基于液相色譜-串聯質譜法研究男寶膠囊中人參投料摻偽*

薛 平，汪嘉麗，王倬暄，李 莉，劉旻虹，顧崢嶸，黃強燕，潘璐艷

常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，常州 213000

男寶膠囊最早名為補腎膠囊，具有補腎壯陽、益精養血之功效，由鹿茸、牡丹皮、黃芪、人參、肉桂、枸杞子等31 味中藥組成，其內容物為暗褐色粉末，味微咸，氣微弱，臨床上主要用于腎陽不足引起的性欲淡漠，陽痿滑泄，腰腿酸痛，腎囊濕冷，精神萎靡，食欲不振等癥[1]。

目前男寶膠囊的質量控制方法主要是關于人參、肉桂和附子等藥味的薄層色譜鑒別[2，3]，淫羊藿苷、丹皮酚和金絲桃苷等成分的含量測定[4-6]，也有針對一家生產企業形成的質量標準草案[7]，然而關于原料藥投料真實性的研究相對較少。

近年來多次報道人參中摻偽西洋參進行含人參制劑的投料生產情況，其中將擬人參皂苷F11為西洋參中特征成分作為非法投料使用的檢驗依據[8]。男寶膠囊是本中心承擔的國家藥品監督管理局2022 年國家藥品抽驗品種，針對上述監管空白，本研究采用液相色譜-串聯質譜法探究男寶膠囊中人參的投料情況，制定合理的摻偽判定原則，為中成藥質量控制和市場監管提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

LCMS-8060 高效液相色譜質譜聯用儀（日本島津有限公司）；XP504 萬分之一電子天平、XP105DR萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統（默克密理博有限公司）。

1.2 試藥與試樣

擬人參皂苷F11對照品（批號110841-202209，含量99.5%）和人參皂苷Rf 對照品（批號111719-201806，含量100%）均購自于中國食品藥品檢定研究院。

男寶膠囊樣品來源于全國30 個省級行政區，共涉及8 家生產企業（編號S1～S8），72 批次樣品。乙腈均為色譜純，甲醇為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件[8-10]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），行梯度洗脫：0 min（20∶80）→2 min（50∶50）→4.5 min（80∶20）；流速0.35 mL·min-1；柱溫40℃；進樣量5 μL。

2.1.2 質譜條件 以三重四極桿串聯質譜儀檢測：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：526℃；DL 管溫度：250℃；載氣流速：2.8 L·min-1；加熱器流量：10 L·min-1；加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L·min-1；采集模式為負離子模式；各化合物監測離子對和碰撞電壓（collision energy，CE）見表1。

表1 化合物質譜測定條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 精密稱取擬人參皂苷F11對照品適量，加甲醇制成100 μg·mL-1的溶液，作為擬人參皂苷F11貯備溶液。精密稱取人參皂苷Rf 的對照品適量，加甲醇制成85 μg·mL-1的溶液，作為人參皂苷Rf 貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液 取男寶膠囊內容物，研細，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置25 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陽性對照溶液 按生產企業S5 的處方比例及工藝，制備含0%、3%、5%、10%、20%、50%和100%西洋參的陽性對照樣品，按“2.2.2”項下方法制備系列陽性對照溶液。

2.3 專屬性實驗

取“2.2”項下的含0%西洋參對照溶液、含100%西洋參陽性對照溶液和對照品溶液（擬人參皂苷F11和人參皂苷線性關系中第三個濃度點），按“2.1”項下條件各進樣5 μL 分析，質譜多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）提取離子對色譜疊加圖見圖1。結果發現0%對照溶液均未檢出擬人參皂苷F11，檢出人參皂苷Rf 色譜峰；含100%西洋參陽性樣品中檢出擬人參皂苷F11色譜峰，未檢出人參皂苷Rf 色譜峰，表明擬人參皂苷F11可作為男寶膠囊中西洋參摻偽的專屬性鑒別成分。

圖1 對照品溶液及對照溶液MRM 提取離子對色譜疊加圖

2.4 線性關系考察

精密吸取擬人參皂苷F11貯備溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為擬人參皂苷F11對照溶液。精密吸取人參皂苷Rf 貯備溶液5 mL，置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為人參皂苷Rf 對照溶液。

分別精密量取擬人參皂苷F11對照溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL 置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制得擬人參皂苷F11系列對照品溶液。分別精密量取人參皂苷Rf 對照溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制得人參皂苷Rf 系列對照品溶液。

按“2.1”項下條件將上述系列對照品溶液進樣測定峰面積，以對照品濃度（ng·mL-1）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得擬人參皂苷F11線性方程為Y=4.854×103X+1.575×103（r=0.999 4），線性范圍1.049～104.900 ng·mL-1；人參皂苷Rf 線性方程為Y=2.963×103X+4.392×103（r=0.998 9），線性范圍4.250～170.000 ng·mL-1。

2.5 定量限與檢測限

取線性關系中對照品溶液稀釋至一定的濃度，按“2.1”項下條件進樣分析。以信噪比為10∶1 時相應濃度計算定量限，以信噪比為3∶1 時相應濃度計算檢測限。定量限與檢測限均折算至樣品，擬人參皂苷F11定量限為0.087 μg·g-1，檢測限為0.035 μg·g-1；人參皂苷Rf 定量限為0.071 μg·g-1，檢測限為0.028 μg·g-1。

2.6 進樣精密度試驗

取對照品溶液（擬人參皂苷F1110.487 ng·mL-1，人參皂苷Rf 42.000 ng·mL-1），按“2.1”項下條件進樣分析，連續進6 針，記錄峰面積。結果擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 峰面積的RSD（n=6）為1.41%和1.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取男寶膠囊樣品（編號S6-4），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣分析，測得擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 平均含量分別為3.478 和24.601 μg·g-1，RSD 分別為6.98%和2.70%（n=6），結果表明本方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取男寶膠囊樣品（編號S3-3），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 內按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf RSD 分別為5.29%和4.78%（n=6），結果表明供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取男寶膠囊樣品（編號S2-1，擬人參皂苷F11含量19.563 μg·g-1，人參皂苷Rf 20.288 μg·g-1）約1.5 g，分別精密加入擬人參皂苷F11貯備溶液0.3 mL，人參皂苷Rf 貯備溶液0.4 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，再按2.1”項下條件進樣分析。根據試驗結果計算含量、回收率、平均回收率，結果（表2）表明本試驗準確度良好。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

2.10 樣品含量測定結果

取不同生產企業的男寶膠囊樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述“2.1”項下條件分析，分別計算樣品中擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf的含量。

8 家生產企業共72 批次樣品，受篇幅限制測定數據不便于一一列出。故將測定結果以不同生產企業為單位，統計生產企業不同批次樣品中擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 含量范圍與平均值，詳見表3。

表3 不同生產企業樣品含量測定結果（μg·g-1，n=2）

3 限度濃度的制定

8 家企業的男寶膠囊生產工藝均是部分原料水提+部分原料30%乙醇提+部分原粉入藥，其中人參均為水煎煮提取。對比各企業生產工藝，詳見表4（秉持對企業生產工藝保密原則，表4 僅列出涉及人參的處方量、制成量和水煎煮提取方式），發現上述生產企業之間存在細微的差異，7 家人參投料量完全一致，生產企業S3 的投料量稍有差異（800 g 膠囊內容物的人參投料量為人參77.8 g），少了接近22%，但該生產企業的男寶膠囊中擬人參皂苷F11含量相對較低，遠遠低于擬定限度的78%（男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11含量為8.3 μg·g-1×78%=6.5 μg·g-1），該企業摻偽風險低。考慮到成本、效率和方法的一致性，故統一制備陽性對照樣品，擬定西洋參摻偽限度。生產企業S5 的生產工藝（800 g 膠囊內容物的人參投料量為人參100 g，煎煮3 次，第一次2 h，第二次1.5 h，第三次1 h）較為均衡兼顧，故參照生產企業S5 的生產工藝陽性對照樣品（模擬摻偽西洋參樣品）。

表4 8 家生產企業人參投料量與制得量生產工藝對比

3.1 摻偽比例考察

取“2.2.3”項下含0%、3%、5%、10%、20%、50%和100%西洋參的陽性對照樣品，按“2.1”項下條件測定，計算樣品中擬人參皂苷F11。陽性對照溶液的陽性對照樣品（模擬摻偽西洋參樣品）使用的西洋參來源為遼寧龍參健康藥業有限公司，批號211001，擬人參皂苷F11含量1.299×103μg·g-1。

測定結果（表5）顯示，當摻入3%的西洋參時，樣品中擬人參皂苷F11已經能被檢出。同時按公式陽性對照樣品測得含量/陽性對照樣品理論含量×100%計算擬人參皂苷F11轉移率，其中陽性對照樣品理論含量=1.299×103μg·g-1（摻入的西洋參擬人參皂苷F11含量）×西洋參摻入比例×12.5%（處方量100 g/800 g）。結果摻入不同比例西洋參樣品中擬人參皂苷F11的平均轉移率為48.67%。

表5 不同摻偽比例樣品中擬人參皂苷F11 的含量（μg·g-1）

以西洋參摻入比例為橫坐標（X），測得的擬人參皂苷F11的含量（μg·g-1）為縱坐標（Y），得到線性方程Y=7.697×101X+5.137×10-3（r=0.997 9），其相關性系數良好，表明西洋參摻入的量跟擬人參皂苷F11的含量呈正相關性。

3.2 摻偽限度擬定

參照已頒布的其他含人參制劑的西洋參檢查補充檢驗方法中判定檢出的依據，考慮實際生產中非主觀原因的混入，同時模擬摻偽陽性對照樣品制備過程中轉移率較大生產高，擬將限度適當放寬，以男寶膠囊中摻西洋參比例大于10%時判定為檢出西洋參，超過擬定限度。

課題組對自行收集的西洋參飲片3 批、西洋參粉1 批、西洋參對照藥材1 批進行擬人參皂苷F11含量測定，結果見表6。

表6 自行收集西洋參中擬人參皂苷F11 的含量

由“3.1”可知，擬人參皂苷F11的平均轉移率為48.67%，結合上述5 批次擬人參皂苷F11的平均含量，計算得男寶膠囊中擬人參皂苷F11應不得超過7.897 μg·g-1（1.298 × 103μg·g-1× 12.5% × 10% ×48.67%），即制備的相應供試品溶液中擬人參皂苷F11濃度為9.48 ng·mL-1。

為便于操作及判斷，根據上述限量折算配制相應濃度（10 ng·mL-1）的對照品溶液（相當于男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11含量為8.3 μg·g-1），規定供試品溶液的色譜峰面積值大于該濃度的對照品溶液中相應的峰面積值，視為檢出西洋參，超過擬定限度。

3.3 判定原則

為簡便生產企業的質量控制和監管，節約資源。人參的質量控制在原料執行《中國藥典》2020 年版中規定的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的基礎上，額外增加成藥單項檢測擬人參皂苷F11即可。故在判定檢出西洋參超過擬定限度原則時，未對人參皂苷Rf 含量進行限定，僅對擬人參皂苷F11進行了詳細要求。

判定原則主要為三種情況：①供試品溶液的提取離子流色譜中，未同時出現與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應的色譜峰，視為未檢出西洋參；②供試品溶液的提取離子流色譜中，同時出現與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應的色譜峰，但供試品色譜中m/z 799.6→653.6 的色譜峰峰面積值不大于擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）相應的峰面積值，視為未檢出西洋參，未超過擬定限度；③供試品溶液的提取離子流色譜中，同時出現與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應的色譜峰，且供試品色譜中m/z 799.6→653.6 的色譜峰峰面積值大于擬人參皂苷F11對照品溶液相應的峰面積值，視為檢出西洋參，超過擬定限度。

4 結果與分析

4.1 結果判定

72 批次男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11，有1批次樣品低于檢測限，其余71 批次含量范圍為0.072～43.260 μg·g-1，人參皂苷Rf 5 批次樣品低于檢測限，67 批次含量范圍為1.070～34.788 μg·g-1。根據“3.2”項下的限度，有22 批次樣品擬人參皂苷F11含量大于8.3 μg·g-1，檢出西洋參，超過擬定限度，問題樣品批次占比為30.56%。

4.2 含量測定結果分析

72 批次樣品結果數據繁雜，不便于結果直觀分析。故將不同生產企業分組繪制含量測定直方圖，以含量測定的結果（μg·g-1）為縱坐標（詳見圖2）。為了更直觀清晰地表述，將人參皂苷Rf 含量用正軸半軸表示，擬人參皂苷F11含量用負半軸表示，圖中低于檢測限的均視為0。從直方圖可見生產企業S7不僅人參皂苷Rf 含量極低，而且擬人參皂苷F11含量異常高，表明整體人參原料質量控制較差。生產企業S1、S4、S3 和S5 的人參質量控制相對較好，人參皂苷Rf含量遠遠高于擬人參皂苷F11含量，同時人參皂苷F11含量極低。

圖2 含量測定直方圖

5 討論

人參與西洋參為同科同屬藥材，外觀性狀與組織結構相似，容易混淆，且西洋參生長周期較人參短，種植成本低。而現行標準中多以兩者共有成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1來進行質量控制，因此存在使用西洋參摻人參進行投料的風險。擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf是一對同分異構體，文獻研究表明擬人參皂苷F11為西洋參中特征成分，人參皂苷Rf 為人參特征成分，可作為非法投料使用的檢驗依據[9，10]。近年來人參中摻西洋參投料是中成藥質量控制研究的熱點，特別是人參生粉入藥的相關中成藥研究已較為完備。然而男寶膠囊此類人參需提取入藥，組方復雜，生產企業多的中成藥相關研究較少[7，8]。

由于諸多原因未能制定男寶膠囊中人參皂苷Rf的限度，客觀原因是現行的人參制劑標準中未有關于人參皂苷Rf限度可以參考，同時生產企業配合度相對不高，制定限度欲望低；主觀原因是實驗室制備小樣所用的原藥材質量佳，提取效率高，可能會導致人參皂苷Rf限度擬定過高，質量標志成分的限度仍需多批次中試和大試樣品的驗證。人參皂苷Rf的限度擬定欲在后期研究中進一步完善。目前本著簡便高效、節約資源的原則，課題組相信生產企業在原料人參執行《中國藥典》2020 年版中規定的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的基礎上，額外增加成藥單項檢測擬人參皂苷F11即可控制男寶膠囊中人參的質量。

通過上述試驗，發現男寶膠囊部分生產企業存在人參中摻西洋參投料的跡象，提示生產企業需加強風險質量管理意識，課題組已向國家藥品監督管理局建議對相關制劑的投料情況進行專項整治檢查。本試驗旨在通過建立男寶膠囊中擬人參皂苷F11限量檢查方法，為生產企業產品質量控制提供參考，鞏固國家監管部門及社會群體對中成藥摻偽的監管，保障中藥質量安全。