基因多態(tài)性對丙戊酸鈉及代謝物血藥濃度的影響及其與不良反應(yīng)的相關(guān)性研究*

顧瀾婷，王雨萍，陸韻竹，許倍銘，陳 冰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 藥劑科，上海 200025

丙戊酸鈉（valproic acid，VPA）是治療癲癇經(jīng)典藥物，治療窗較窄，治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）常用于VPA 臨床治療，有效血藥濃度范圍為50～100 μg·mL-1[1]。多數(shù)患者服用VPA較為安全，但仍有不良反應(yīng)發(fā)生，其中肝毒性是最需警惕的不良反應(yīng)，因此需要定期檢查肝功能[2]。研究報(bào)道肝功能損傷的不良反應(yīng)可能與其代謝過程相關(guān)，VPA 在體內(nèi)經(jīng)過不同代謝途徑，形成50 多種代謝物，其中2-丙基-2-戊烯酸（2-propyl-2-pentenoic acid，2-ene-VPA）是VPA 主要的代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)經(jīng)線粒體β 氧化產(chǎn)生，具有抗癲癇活性，同時(shí)也可能導(dǎo)致胰腺炎和高氨血癥等不良反應(yīng)[3]；2-丙基-4-戊烯酸（2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene-VPA）可能是與肝毒性相關(guān)的主要代謝物之一[4]。同時(shí)研究表明[5]，VPA 的部分不良反應(yīng)發(fā)生與遺傳因素有密切關(guān)系，可能與肝功能損傷相關(guān)的基因包括細(xì)胞色素 P450 2C9（cytochrome P450 2C9，CYP2C9）、尿苷葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine glucuronate transferase，UGTs）、氨甲酰磷酸合酶1（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）、線粒體聚合酶（mitochondrial polymerase gamma，POLG）、過 氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等，其中CYP2C9、UGTs 在VPA 代謝中具有重要作用。本文研究基因多態(tài)性對中國人群中VPA 及其代謝物血藥濃度的影響，并探討后者與肝功能損傷之間的關(guān)系，以期為制定中國人群個(gè)體化的VPA 藥物治療方案、避免不良反應(yīng)發(fā)生提供依據(jù)。

1 一般資料

納入2022 年12 月～2023 年5 月于我院診斷為癲癇的患者共99 人，其中男性60 人，女性39 人，年齡（52.72±20.91）歲（7～95 歲），體重（64.36 ±14.73）kg，服用丙戊酸鈉片（200 mg ∶100 片/瓶，湖南省湘中制藥有限公司）、丙戊酸鈉緩釋片[0.5 g ∶30片/瓶，賽諾菲（杭州）制藥有限公司]或丙戊酸鈉口服溶液[12 g ∶300 mL/瓶，賽諾菲（杭州）制藥有限公司]，服用劑量為300～1600 mg·d-1,用法用量個(gè)體化差異大，部分為800 mg bid、200 mg tid、200 mg bid、400 mg tid、400 mg bid、早200 mg 晚100 mg 等。患者常規(guī)進(jìn)行VPA 濃度監(jiān)測，共收集常規(guī)TDM 和剩余樣本144 份，其中檢測1 次、2 次、3 次及以上分別為65、25、9 人。

2 主要儀器

3730XL 型DNA 序列檢測儀（美國賽默飛ABI公司）；API4000 型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems 公司）；UFLC 色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；5804R 臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。

3 方 法

3.1 標(biāo)本采集

患者采集血樣前，血藥濃度已達(dá)到穩(wěn)態(tài)（VPA半衰期為7～10 h，經(jīng)過4～5 個(gè)半衰期），于次日早晨服藥前靜脈采血3 mL，分離上層血清于-20℃保存，用于VPA 及其代謝物血藥濃度檢測；同時(shí)下層血凝塊部分用于提取DNA 并基因檢測。通過我院信息系統(tǒng)收集監(jiān)測當(dāng)日患者肝功能指標(biāo)。

3.2 VPA 及代謝物血藥濃度檢測

精密吸取血清樣本100 μL 至1.5 mL 離心管中，采用LC-MS/MS 法檢測患者VPA 及代謝物2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度，檢測方法參考文獻(xiàn)[6]并作修改，采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）分離；流動相A 相為5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，B 相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～0.5 min，20% B；0.5～6 min，20%→85%B；6～6.5 min，85%→95%B；6.5～7 min，95% B；7～9.1 min，95%→20% B；7.1～10 min，20% B；流速0.30 mL·min-1；柱溫40℃。采用電噴霧離子化電離源（electron spray ionization，ESI），負(fù)離子方式檢測，多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）定量。試驗(yàn)回收率、精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，穩(wěn)定性良好。在分析基因多態(tài)性對血藥濃度的影響時(shí)，為消除患者體重與服藥劑量對血藥濃度的影響，將所得血藥濃度除以體重與服藥劑量，得到單位體重劑量的校正血藥濃度。

3.3 基因檢測

從血樣中提取DNA，設(shè)計(jì)不同長度的引物SNaPshot 反應(yīng)后，檢測多個(gè)SNP 位點(diǎn)，詳見表1。DNA 樣本取1 μL 稀釋到工作濃度5～10 ng·μL-1，引物稀釋到工作濃度50 μmol·L-1。多重PCR 反應(yīng)：4 μL 擴(kuò)增引物Premix，10 μL ExTaq（HS），2 μL DNA，4 μL H2O，反應(yīng)條件為95℃2 min 后，95℃20 s，65°（TD-0.5/C）40 s，72℃1 min，共12 個(gè)循環(huán)，然后95℃20 s，59℃30 s，72℃1 min，共24 個(gè)循環(huán)后72℃10 min，在4℃保存。PCR 產(chǎn)物純化：在15 μL PCR 產(chǎn)物中加入5 U SAP 酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。SNaPshot 延伸反應(yīng)：5 μL SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2 μL 純化后多重PCR 產(chǎn)物，1 μL 延伸引物Premix，2 μL H2O，反應(yīng)條件為95℃10 s，然后95℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)，60℃30 s，在4℃保存。基因型分析采用ABI 3730XL 測序儀基因測序儀完成，利用GeneMapper 4.0（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA）軟件分析數(shù)據(jù)。采用直接測序法檢測UGT2B7 rs12233719、UGT1A6 rs2070959 兩個(gè)位點(diǎn)。

表1 基因多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件分析，Hardy-Weinberg 定律檢驗(yàn)等位基因型頻率是否具有符合遺傳規(guī)律，計(jì)數(shù)資料以“%”表示，計(jì)量資料以（）表示，采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。相關(guān)性研究采用皮爾遜相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般資料

99 位患者VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度詳見表2。根據(jù)年齡、性別分組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

表2 99 位患者年齡與VPA 及其代謝血藥濃度的值（）

表2 99 位患者年齡與VPA 及其代謝血藥濃度的值（）

4.2 基因型及等位基因分布頻率

99 位患者UGT2B7（rs12233719、rs7668258）、UGT1A6（rs2070959、rs1105879、rs89910）、CAT rs1001179、CPS1 rs1047891、SOD2 rs4880 基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表3。3 位患者未檢測到rs7668258 位點(diǎn)，3 位患者未檢測出rs3087374 位點(diǎn)，可能存在位點(diǎn)缺失；CYP2C9 rs1057910 在檢測人群中均為AA 型，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此未列入后續(xù)分析。

表3 99 位患者候選基因的基因型與等位基因分布頻率[n（%）]

4.3 藥物代謝酶基因多態(tài)性與VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 校正血藥濃度

99 位患者基因多態(tài)性與校正血藥濃度的結(jié)果詳見表4。UGT2B7 rs7668258 TT 型患者2-ene-VPA 校正血藥濃度低于CC/CT 型（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血藥濃度顯著高于CC 型患者（P ＜0.05），其余基因型與濃度之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。結(jié)果表明UGT1A6、UGT2B7 基因多態(tài)性可能影響VPA 代謝物濃度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)UGT1A6 rs89910基因型分組，UGT2B7 rs7668258 不同基因型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

表4 99 位患者候選基因的基因型與等位基因分布頻率[n（%）]

4.4 VPA 及代謝物水平、基因多態(tài)性對肝功能的影響

本研究未發(fā)現(xiàn)肝功能損傷的患者，采集反映肝功能的指標(biāo)，包括谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（as-partate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL），探索其與VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度的關(guān)系。結(jié)果（表5）表明VPA 與ALT、AST、ALP 水平相關(guān)，而4-ene-VPA 與ALT 相關(guān)。進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與肝功能指標(biāo)是否存在相關(guān)性，將肝功能指標(biāo)根據(jù)基因多態(tài)性進(jìn)行分組檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，CPS1 rs1047891 CC 型ALT、ALP 水平顯著低于AA/AC 型患者，CC型與AA/AC 型患者的ALT 分別為（27.86±23.23）和（46.54±51.26）U·L-1（P=0.033）；ALP 分別為（79.41±31.37）和（97.83±47.28）U·L-1（P=0.049）。

表5 VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血藥濃度與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

5 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)VPA 的肝功能損傷與其代謝過程及相關(guān)酶基因多態(tài)性有關(guān)。VPA 在體內(nèi)主要有3條途徑代謝：①線粒體的β-氧化途徑，主要生成2-ene-VPA 等，約占代謝過程的40%；②細(xì)胞色素P450 氧化代謝途徑，經(jīng)CYP2C9 等代謝，主要生成4-ene-VPA；③UGT 是Ⅱ相代謝途徑，通過UGT1A6、UGT2B7 等同功酶代謝生成親水性的葡萄糖醛酸丙戊酸代謝物[7]。VPA 氧化代謝消耗體內(nèi)抗氧化物質(zhì)，并能抑制線粒體β-氧化，導(dǎo)致活性氧簇大量積聚，加重肝細(xì)胞損傷壞死，可能是VPA 誘導(dǎo)肝毒性的重要原因，而UGT 催化生成Ⅱ相代謝物經(jīng)腎臟排出體外，可以發(fā)揮解毒作用。不同藥物代謝酶基因多態(tài)性可能影響VPA 及代謝物濃度水平，進(jìn)而與肝功能損傷等不良反應(yīng)相關(guān)。PharmGKB 數(shù)據(jù)庫 將rs12233719、rs7668258、rs2070959、rs1105879、rs89910、rs3087374、rs1001179、rs4880、rs1057910、rs1047891 基因與VPA 的肝臟毒性聯(lián)系判定為3級，而相關(guān)研究在中國患者中開展較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于患者體內(nèi)的VPA 及其代謝物血藥濃度，性別與年齡并不是其影響因素（P ＞0.05）。UGT 基因型對VPA 及其代謝物濃度具有影響，UGT2B7 rs7668258 CC/CT 組患者2-ene-VPA校正血藥濃度顯著高于TT 組（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血藥濃度則均顯著高于CC 組患者（P ＜0.05）。前期研究表明[8]，兒童UGT1A6 基因多態(tài)性與VPA 的濃度和耐受性方面的臨床結(jié)果無明顯相關(guān)性。造成差異性的原因可能是兒童UGTs 表達(dá)低于成人，使基因多態(tài)性對VPA 的影響被相互作用等情況掩蓋[9]。本研究發(fā)現(xiàn)UGTs 在VPA 的代謝中發(fā)揮了重要作用，在UGTs 活性強(qiáng)的情況下，更多VPA 經(jīng)Ⅱ相代謝，相應(yīng)減少氧化途徑代謝，在長期應(yīng)用的情況下，患者VPA 代謝物在體內(nèi)蓄積減少，可能進(jìn)一步影響VPA的療效與不良反應(yīng)的發(fā)生[10，11]。

AST、ALT、ALP、DBIL、TBIL 是臨床反映肝臟功能的常規(guī)指標(biāo)。本次研究結(jié)果表明，VPA 血藥濃度與AST、ALT、ALP 相關(guān)，4-ene-VPA 血藥濃度與ALT 具有一定相關(guān)性，結(jié)果與前期報(bào)道一致[12]，VPA與代謝物4-ene-VPA 可能是VPA 所致肝功能損傷的原因。本研究未發(fā)現(xiàn)肝功能嚴(yán)重?fù)p傷患者，大多數(shù)患者肝功能指標(biāo)也在正常范圍，可能是研究結(jié)果相關(guān)系數(shù)較低的原因。本次研究也進(jìn)一步探索了基因多態(tài)性與VPA 所致肝功能損傷之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPS1 rs1047891 CC 型與AA/AC 型患者相比，兩組在ALP、ALT 水平均具有顯著差異。CPS1表達(dá)于肝臟線粒體內(nèi)，是催化尿素循環(huán)第一步反應(yīng)，使肝臟發(fā)揮解毒功能的關(guān)鍵酶之一，CPS1 rs1047891 CC 型患者解毒能力強(qiáng)，AA/AC 型患者比CC 型患者更容易引起VPA 的肝功能損傷，但是其影響的機(jī)制還有待進(jìn)一步證明。

研究報(bào)道CAT rs1001179 在健康組和肝功能異常組中基因多態(tài)性也存在顯著差異[13]，POLG 在細(xì)胞中發(fā)揮mtDNA 合成和修復(fù)作用，其突變與VPA 誘導(dǎo)的肝毒性有直接關(guān)系[14]。本次研究中未證實(shí)兩者與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。原因可能包括：①這些基因多態(tài)性與肝功能相關(guān)，但可能并非是VPA引起肝功能改變的特異指標(biāo)；②本研究納入的患者中未發(fā)生嚴(yán)重肝功能損傷，POLG、CAT 等基因多態(tài)性的影響未能充分體現(xiàn)。此外，本研究未將合并用藥作為影響因素研究，具有一定局限性，后期需進(jìn)一步擴(kuò)大患者樣本量，充分考察各方面因素的影響。

本次研究初步探討了基因多態(tài)性對丙戊酸鈉及代謝物血藥濃度的影響及其與不良反應(yīng)的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)UGT1A6、UGT2B7 基因多態(tài)性與VPA 代謝物2-ene-VPA 水平相關(guān)；VPA 及其代謝物4-ene-VPA可能影響肝功能指標(biāo)，CPS1 rs1047891 基因多態(tài)性影響ALT、ALP 水平，VPA 及代謝物濃度及基因多態(tài)性可能是肝臟損傷的原因。在進(jìn)一步研究基礎(chǔ)上，建立VPA 及其代謝物與基因多態(tài)性與肝功能損傷更加明確的關(guān)系，為VPA 患者提供更安全、更科學(xué)的個(gè)體化治療方案。